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免疫組化染色科研實驗技術(shù)服務(wù)介紹
閱讀：31 發(fā)布時間：2024-10-11免疫組化染色
技術(shù)原理
免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理——抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。
實驗步驟
1、石蠟切片制片，組織取樣后應(yīng)立即放入固定液中，避免凍存;
2、冰凍切片制片應(yīng)取用新鮮組織，以免抗原丟失;
3、組織蠟塊可以保存很長時間，但是石蠟切片理論上不能超過半年。冰凍切片不能超過3個月。
注意事項
1. 蘇木素復(fù)染時間需要摸索，尤其陽性染色也在細(xì)胞核上。
2. DAB顯色時間需要達(dá)到優(yōu)化，鏡下觀察達(dá)到陽性染色明顯但背景不太深。
3. 抗體孵育時間和抗體濃度需要摸索。尤其一抗孵育最好在4度過夜。
4. 切片脫蠟和水化要充分；加反應(yīng)液時要覆蓋組織充分；每次加液前甩干洗滌液，但又防止干片；用組化筆畫圈時盡量畫大一點，否則墨水排斥液體，引起片周邊干片。
常見問題
片子著色不均勻？
脫蠟不充分?？梢?0 ℃烤20 min，立即放入新鮮的xylene1；
水化不全。應(yīng)經(jīng)常配制新鮮的梯度乙醇；
抗體沒混勻。用移液器充分混勻一抗/二抗等試劑；
抗體孵育時，切片放傾斜；
抗體孵育后PBS沖洗不充分。
制片厚薄不均勻等問題。染片盒不平，切片傾斜。
一抗從4 ℃拿出后，為什么有人說要37度復(fù)溫，目的是什么？
一方面，防止切片從4 ℃直接放入PBS易脫片；
另一方面，使抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。一般不需要,但對表達(dá)較弱的抗原可能有用,4 ℃和37 ℃度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小于后者,后者結(jié)合更快,但敏感性也提高了并易造成非特異染色。
切片染色后背景太深，不易區(qū)分特異性與非特異性著色？
抗體孵育時間過長、抗體濃度高易增加背景著色。這可通過縮短一抗/二抗孵育時間、稀釋抗體來控制；
一抗用多克隆抗體易出現(xiàn)非特異性著色，建議試用單克隆抗體看看；
內(nèi)源性過氧化物酶和生物素在肝臟、腎臟等組織含量很高，需要通過延長滅活時間和增加滅活劑濃度來降低背景染色；
非特異性組分與抗體結(jié)合，這需要通過延長二抗來源的動物免疫血清封閉時間和適當(dāng)增加濃度來加強封閉效果；
DAB顯色時間過長或濃度過高；
PBS沖洗不充分，殘留抗體結(jié)果增強著色；
標(biāo)本染色過程中出現(xiàn)干片，易增強非特異性著色。