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赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑
【概要】
赭曲霉毒素A （Ochratoxin A）是曲霉屬和青霉屬的真菌形成的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬烈性的腎臟毒和肝臟毒，廣泛存在于各種食物中。谷物及其副產(chǎn)品是赭曲霉毒素A的主要來(lái)源。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明攝入了被這種毒素污染的飼料后，會(huì)發(fā)生急性或慢性中毒癥。防止污染赭曲霉毒素A的食品和飼料直接或間接地進(jìn)入人類(lèi)食物鏈，加強(qiáng)對(duì)赭曲霉毒素A的檢測(cè)十分重要。
赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑【適范圍】
可定性、定量檢測(cè)谷物、飼料、面粉、啤酒、紅酒、飲料等樣本中的赭曲霉毒素A。
赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑【試驗(yàn)原理】
本試劑盒采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA，在微孔板上預(yù)包被赭曲霉毒素A抗原，加入樣本/赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。樣本或標(biāo)準(zhǔn)品溶液中的赭曲霉毒素A與預(yù)包被在微孔板上的赭曲霉毒素A抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的赭曲霉毒素A抗體。未結(jié)合的酶標(biāo)抗體在洗滌時(shí)被除去，再加入顯色液，讀取吸光值。樣本的吸光值與其所含殘留物赭曲霉毒素A抗原的含量成負(fù)相關(guān)。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得出相應(yīng)殘留物赭曲霉毒素A的含量。
赭曲霉毒素A-ELISA檢測(cè)試劑【試劑盒靈敏度】
試劑盒靈敏度：1ppb
【交叉反應(yīng)率】
結(jié)構(gòu)類(lèi)似物 交叉反應(yīng)率
赭曲霉毒素A …………………………………………………………… 100%
赭曲霉毒素B …………………………………………………………… 43%
赭曲霉毒素C …………………………………………………………… 5%
【試劑盒組成】
1. 96孔板×1塊
2. 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（2ml/瓶）
0ppb, 1ppb, 3ppb, 9ppb, 18ppb, 54ppb
3. 酶標(biāo)物 1瓶 …………………………………… 7ml
4. 顯色液1瓶 …………………………………… 12ml
5. 終止液1瓶 …………………………………… 10ml
6. 濃縮洗滌液（10×）1瓶 …………………… 50ml
7. 濃縮樣品稀釋液（10×）1瓶……………… 20ml
【需要而未提供的設(shè)備及試劑】
設(shè)備：
---微孔板酶標(biāo)儀450nm
---振蕩器
---粉碎機(jī)
---離心機(jī)
---微量天平
---微量移液器：?jiǎn)蔚?20μl～200μl、200μl～1000μl、多道 300μl
試劑：
---去離子水（或蒸餾水）
---二氯甲烷
---鹽酸
---NaHCO3
【試劑配制】
1. 樣品稀釋液：將濃縮樣品稀釋液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮樣品稀釋液+9份去離子水）。
2. 洗滌工作液：將濃縮洗滌液用去離子水按1:9體積比進(jìn)行稀釋（1份濃縮洗滌液+9份去離子水）。
【樣品前處理步驟】
一、谷物與飼料（稀釋倍數(shù)：2.5）
1. 稱取1g粉碎的樣品，加入0.5ml 0.13M NaHCO3，震蕩1min，
2. 加入2ml樣品稀釋液，震蕩5min；
3. 室溫下，2000g離心15min；
4. 取100μl待測(cè)。
二、果汁、啤酒、飲料（稀釋倍數(shù)：1）
1. 碳酸飲料應(yīng)去除CO2（60℃水浴或振蕩去除）
2. 取2ml 樣品，加入 1ml 1mol/L HCl 振勻，加入2ml CH2Cl2 振勻 3min；
3. 室溫下，3500g離心10min；
4. 去除上層液，吸取下層1ml,加入800μl樣品稀釋液，強(qiáng)烈振蕩3min；
5. 室溫下，3500g離心10min；
6. 取480μl上層液，加入120μl甲醇，振蕩均勻，取100μl待測(cè)。
【檢測(cè)步驟】
一、 測(cè)定前須知：
1. 使用之前將所有試劑和所需板條回溫（20～25℃）。
2. 使用之后立即將所有試劑及剩余板條放置2～8℃，干燥環(huán)境保存有利于保持試劑穩(wěn)定性。。
3. ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA操作中的要點(diǎn)。
4. 在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板。
二、操作步驟：
1. 將所需試劑及微孔板取出，放置室溫（20～25℃）30min以上，液體試劑使用前均須搖勻。
2. 取出所需數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板與干燥劑一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷凍。
3. 洗滌工作液在使用前也需回溫。
4. 將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5. 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl到對(duì)應(yīng)的微孔中，加入酶標(biāo)物50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
6. 小心揭開(kāi)蓋板膜，用洗滌工作液充分洗滌，300μl/孔，洗板5次，每次間隔30s，用吸水紙拍干。
7. 加入顯色液100μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫避光反應(yīng)15min。
8. 加終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)酶標(biāo)儀于450nm處讀取每孔OD值。
【結(jié)果判定】
1. 百分吸光率的計(jì)算
標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即
百分吸光率（%）＝ B/B0 ×100%
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0(ppb)標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中赭曲霉毒素A實(shí)際量。
【注意事項(xiàng)】
1. 室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有恢復(fù)到室溫（20～25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2. 在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3. 每種試劑使用前均需搖勻。
4. 反應(yīng)終止液為0.5M硫酸，避免接觸皮膚。
5. 不要使用過(guò)了有效期的試劑盒；也不要摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6. 儲(chǔ)存條件：
試劑盒保存于2～8℃，不能冷凍，將不用的微孔板重新真空密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的顯色劑對(duì)光敏感，因此要避光保存。
7. 試劑變質(zhì)的跡象：
顯色試劑有任何顏色表明顯色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。
8. 加入顯色液后，一般顯色時(shí)間為15～30min。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到35min（或更長(zhǎng)），但不得超過(guò)40min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。
9. 該試劑盒*反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【樣品zui低檢測(cè)限】
谷物、飼料 …………………………………………… 2.5ppb
果汁、啤酒、飲料 …………………………………… 1ppb
【貯藏條件及保存期】
貯藏條件：保存試劑盒于2～8℃。
保存期：該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月。