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退火溫度是PCR反應中的重要影響因素
閱讀：20705 發(fā)布時間：2021-8-3
PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）是一種在體外特異性擴增靶DNA序列的的技術，通過多個循環(huán)的變性、退火和延伸，能夠使微量的遺傳物質(zhì)在幾小時內(nèi)得到幾百萬倍的擴增。其基本過程為變性、退火和延伸，這三步需要不同的溫度條件。
那么，怎樣確定退火溫度？
退火溫度主要取決于引物的堿基組成、長度和濃度。而合適的退火溫度對PCR反應的特異性尤為關鍵。一般來說，退火溫度的高低影響同時影響PCR反應的特異性和靈敏性（擴增效率），且兩者呈負相關，即較低的退火溫度可提高PCR反應的靈敏性但其特異性較差，而較高的退火溫度則可以提高反應的特異性但卻降低了其擴增效率。
通常，在Tm值允許范圍內(nèi)選擇偏高的退火溫度以提高PCR反應的特異性。當然，實際的退火溫度還是要以對應的PCR反應的要求做出調(diào)整。
事實上，根據(jù)退火溫度的文字性定義可以看出，退火溫度的設定與引物的Tm值(熔解溫度)有一定的關系。因此大多數(shù)童鞋在設定退火溫度時，會以兩條引物中較低的Tm值再減去5℃。
而對于Tm值的確定，又是一個問題。商品化的引物會有一個建議的Tm值，而自己合成的Tm值需要進行計算，可以通過引物設計軟件（primer premier 5.0，Oligo 6.22等）或在線的引物設計網(wǎng)站進行Tm值的確定。但由于計算方法的不同，同樣一段引物在不同引物設計軟件或網(wǎng)站得到的Tm值有所差別。
種種以上，我們不難看出一個合適的退火溫度并不好確定。因此，優(yōu)化退火溫度理想的方法是設置一系列的對照反應，即通過在低于計算出的引物Tm值2~10℃的溫度范圍內(nèi)進行退火的一系列平行反應來確定退火溫度。
溫度梯度PCR儀是在普通PCR儀基礎上帶有設置溫度梯度功能的PCR儀，梯度PCR儀除具有普通PCR儀的結構外，還具有特殊的梯度模塊，可實現(xiàn)對梯度溫度和梯度時間等參數(shù)的調(diào)整。因此可以在一次實驗中對不同樣品設置不同的退火溫度和退火時間，從而可在短時間內(nèi)對PCR實驗條件進行優(yōu)化，提高PCR科研效率。