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ELISA 操作及方法
閱讀：174 發(fā)布時間：2019-6-24ELISA 操作及方法
• ELISA 所需的對照樣品
• 夾心 ELISA 實驗方案
• ELISA 分析
• 計算和評估 ELISA 數(shù)據(jù)
• ELISA 疑難解答提示
選擇適合的方法來分析 ELISA 數(shù)據(jù)。
ELISA 實驗可根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)類型被分為以下幾類：
• 定性 ELISA 只用于確定樣品中是否有抗原存在。檢測需要一個不包含抗原或包含無關(guān)對照抗原的空白對照孔。
• 半定量 ELISA 用于對樣品間的抗原水平進行相對比較。
• 定量 ELISA 用于計算樣品中的抗原含量。實驗中需要比較由樣品測定得到的數(shù)值和由已知濃度純化的抗原梯度稀釋液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線。這是常用的 ELISA 數(shù)據(jù)。
ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線
標(biāo)準(zhǔn)或校正曲線是定量 ELISA 實驗的要素，它們可用于計算樣品中抗原的濃度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過繪制已知的參考抗原濃度與每一濃度(通常是450 nm處的光密度)的讀數(shù)之間的關(guān)系得出的。
大部分 ELISA 酶標(biāo)儀將加入用于曲線擬合和數(shù)據(jù)分析的軟件。通過外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分計算樣品中抗原的濃度。
圖 1：來自人 ICAM1 SimpleStep ELISA® 試劑盒 (ab174445) 的定量 ELISA 實驗標(biāo)準(zhǔn)曲線的例子。
曲線擬合軟件允許您使用不同的模型繪制您的數(shù)據(jù)。
• 線性圖的一個坐標(biāo)軸表示抗原的濃度，另一個表示讀數(shù)。R2 值在此通常用于確定擬合，數(shù)值大于 0.99 表示擬合非常好。然而，線性圖往往會壓縮曲線下端上的數(shù)據(jù)點，導(dǎo)致計算結(jié)果不準(zhǔn)。
• 半對數(shù)圖可以幫助抵消線性圖引起的下端壓縮。半對數(shù)圖使用濃度的對數(shù)與讀數(shù)的關(guān)系。這種方法通常會得到數(shù)據(jù)點分布更均勻的 s 形曲線。
• 對數(shù)/對數(shù)圖可以為低到中濃度范圍提供良好的線性。但范圍的則容易失去線性。
• 4 或 5 參數(shù)邏輯（4PL 或 5PL）曲線是更為復(fù)雜的方法，考慮了其他參數(shù)比如大值和小值，因此需要更復(fù)雜的計算。4PL 假設(shè)拐點周圍對稱，而 5PL 考慮了不對稱的情況，通常更適合免疫分析。
如果您的軟件允許，則 4-PL 和 5-PL 將適用于大部分 ELISA 校正標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果您的軟件不允許，則的選擇是使用半對數(shù)或?qū)?shù)/對數(shù)圖。