GB/T 42430—2023血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇檢驗氣相色譜法
1 范圍
本文件描述了采用頂空氣相色譜(HS/GC) 和頂空氣相色譜-質(zhì)譜(HS/GC-MS) 檢驗血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇的方法。
本文件適用于血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空氣相色譜-質(zhì)譜定性分析和頂空氣相色譜定性定量分析。其他體液和非生物樣品可參照使用。
2 規(guī)范性引用文件
下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。
GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法
GA/T 122 毒物分析名詞術(shù)語
3 術(shù)語和定義
GA/T122 界定的術(shù)語和定義適用于本文件。
4 原理
根據(jù)乙醇等6種化合物易揮發(fā)的特性，經(jīng)與平行操作的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)比較，采用頂空氣相色譜(HS/GC) 檢測，依據(jù)兩種不同性質(zhì)色譜柱的保留時間進(jìn)行定性，以峰面積為依據(jù)，內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量。或采用頂空氣相色譜-質(zhì)譜(HS/GC-MS) 檢測，依據(jù)保留時間、質(zhì)譜特征碎片離子進(jìn)行定性。
5 試劑、儀器和材料
5.1 試劑
5.1.1 水，符合 GB/T 6682 規(guī)定的三級。
5.1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：乙醇、甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇、叔丁醇，純度均不小于99.5%。
5.1.3 10.0 mg/mL乙醇(甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液：分別精密稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乙醇(甲醇、正丙醇、丙酮、異丙醇、正丁醇)適量，用水配制成10.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液，0℃~4℃保存，有效期6個月。實驗中所用其他濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液均由10.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液用水
逐級稀釋得到?；虿捎檬惺蹣?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液。
5.1.4 5.0 mg/mL 內(nèi)標(biāo)物叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液：精密稱取500.0 mg 叔丁醇至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，0 ℃~4 ℃保存，有效期6個月。
5.1.5 0.04 mg/mL內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液：精密吸取5.0 mg/mL 內(nèi)標(biāo)物叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲備溶液0.8 mL至100 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，0 ℃~4 ℃保存，有效期3個月。
5.2 儀器和材料
5.2.1 氣相色譜儀：配有氫火焰離子化檢測器(FID)。
5.2.2 氣相色譜-質(zhì)譜儀：配有電子轟擊(EI) 源。
5.2.3 電子天平：分度值(d) 小于或等于0.1 mg。
5.2.4 頂空自動進(jìn)樣器。
5.2.5 移液器：1.0 mL 和0.1 mL。
5.2.6 頂空進(jìn)樣瓶：10 mL。
5.2.7 硅橡膠墊。
5.2.8 鋁帽。
5.2.9 密封鉗。
5.2.10 恒溫水浴鍋：控溫精度士2.0 ℃。
5.2.11 注射器：1 mL。
6 分析步驟
6.1 定性分析
6.1.1 檢材樣品制備
取檢材樣品血液或尿液100μL 及0.04 mg/mL 內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液500 μL(采用外標(biāo)法時，以水代替內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液)置于頂空進(jìn)樣瓶內(nèi)，蓋上硅橡膠墊，用密封鉗加封鋁帽，混勻，置于頂空自動進(jìn)樣器樣品架上進(jìn)樣，或置于65 ℃恒溫水浴中加熱10 min, 用 1 mL 注射器吸取瓶內(nèi)液面上氣體0.4 mL,進(jìn)樣。
6.1.2 質(zhì)控樣品制備
取質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL 待測目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL, 作為添加樣品，與檢材樣品平行操作。
取水100 μL, 作為空白樣品，與檢材樣品平行操作。
6.1.3 儀器條件
6.1.3.1 氣相色譜儀參考條件
用氣相色譜法定性時應(yīng)選用兩根不同性質(zhì)的色譜柱進(jìn)行分析。
以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實際情況進(jìn)行調(diào)整。
a) 色譜柱型號可選擇但不限于以下四種：
1) BAC1(30m×0.32 mm×1.8μm)柱或等效色譜柱；
2) BAC2(30 m×0.32 mm×1.2 μm)柱或等效色譜柱；
3) ALC1(30m×0.32 mm×1.8 μm)柱或等效色譜柱；
4) ALC2(30 m×0.32 mm×1.2 μm)柱或等效色譜柱。
b) 柱溫：恒溫40 ℃。
c) 進(jìn)樣口溫度：150 ℃。
d) 檢測器溫度：300 ℃。
e) 載氣：氮氣。
f) 柱流量：4 mL/min。
6.1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜儀參考條件
以下為參考條件，可根據(jù)不同品牌儀器和不同樣品等實際情況進(jìn)行調(diào)整：
a) 色譜柱：聚乙二醇固定相(30 m×0.32 mm×0.25μm)色譜柱或等效色譜柱；
b) 柱溫：42℃保持3 min, 以25℃/min 升溫至120 ℃保持4 min;
c) 載氣：氦氣；
d) 流速：1.25 mL/min;
e) 進(jìn)樣量：0.4 mL;
f) 分流比：10:1;
g) 進(jìn)樣口溫度：160 ℃;
h) EI 源電壓：70 eV;
i) 溶劑延遲：1.50 min;
j) 離子源溫度：230 ℃;
k) 四極桿溫度：150 ℃;
1) 接口溫度：180℃;
m) 采集方式：全掃描(SCAN);
n) 乙醇等6種化合物及內(nèi)標(biāo)物的保留時間與特征碎片離子見表1。
6.1.3.3 頂空自動進(jìn)樣器參考條件
頂空自動進(jìn)樣器參考條件：
a) 加熱箱溫度：65℃;
b) 定量環(huán)溫度：105℃;
c) 傳輸線溫度：110 ℃;
d) 氣相循環(huán)時間：7.5 min;
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GB/T 42430—2023
e) 樣品瓶加熱平衡時間：10.0 min;
f) 樣品瓶加壓時間：0.10 min;
g) 定量環(huán)平衡時間：0.05 min;
h) 進(jìn)樣時間：1.00 min。
6.1.4 進(jìn) 樣
分別取空白樣品、添加樣品和檢材樣品按6.1.3 條件進(jìn)行檢測。進(jìn)樣順序應(yīng)確保結(jié)果有效。
6.2 定量分析
6.2.1 樣品制備
取檢材樣品血液或尿液100 μL各兩份，按6.1.1 操作。
采用單點校正法定量，取與檢材樣品等量的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份，與檢材樣品平行操作，得到添加樣品，檢材樣品中目標(biāo)物濃度應(yīng)在添加樣品中目標(biāo)物濃度的(100±30)%內(nèi)。
采用校準(zhǔn)曲線法定量，配制系列濃度目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度取與檢材樣品等量的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液各兩份，得到系列濃度的添加樣品，與檢材樣品平行操作。檢材樣品中目標(biāo)物濃度應(yīng)在校準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r) 不小于0.997。
6.2.2 儀器參考條件
氣相色譜儀參考條件見6.1.3.1,頂空自動進(jìn)樣器參考條件見6.1.3.3。
6.2.3 進(jìn) 樣
分別取檢材樣品、系列濃度的添加樣品或單點濃度的添加樣品，按6.2.2條件進(jìn)樣分析。
6.2.4 結(jié)果計算
6.2.4.1 含量計算
6.2.4.1.1 內(nèi)標(biāo)-校準(zhǔn)曲線法
記錄檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積值，以添加樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為縱坐標(biāo)、添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物的峰面積比，按公式(1)計算出檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度。
式中：
w—— 檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);
Y—— 檢材樣品中目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)物叔丁醇的峰面積比；
a 線性方程的截距；
b ——線性方程的斜率。
……… …… (1)
6.2.4.1.2 內(nèi)標(biāo)-單點校正法
記錄檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物和內(nèi)標(biāo)物的峰面積值，根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)物的峰面積，按公式(2)計算出檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度、
式中：
w —— 檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);
A —— 檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積；
A′—— 添加樣品中目標(biāo)物的峰面積；
A;—— 檢材樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；
A 添加樣品中內(nèi)標(biāo)物的峰面積；
w’—— 添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)。
6.2.4.1.3 外標(biāo)-校準(zhǔn)曲線法
記錄檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物的峰面積值，以添加樣品中目標(biāo)物峰面積為縱坐標(biāo)、添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到線性方程。根據(jù)檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積，按公式(3)計算出檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度。
式中：
o ——檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);
Y—— 檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積；
a ——線性方程的截距；
b ——線性方程的斜率。
… … ……(3 )
6.2.4.1.4 外標(biāo)-單點校正法
記錄檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物的峰面積值，根據(jù)檢材樣品和添加樣品中目標(biāo)物的峰面積，按公式(4)計算出檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度。
式中：
w —— 檢材樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);
A —— 檢材樣品中目標(biāo)物的峰面積；
w’—— 添加樣品中目標(biāo)物的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL);
A′—— 添加樣品中目標(biāo)物的峰面積。
…………… ……(4 )
6.2.4.2 相對相差計算
記錄兩份平行操作的檢材樣品含量，按公式(5)計算相對相差。
公式中：RD —— 相對相差；
…… …… (5)
w1、o2——兩份檢材樣品平行定量測定的質(zhì)量濃度，單位為毫克每毫升(mg/mL)。
》 ——兩份檢材樣品平行定量測定的質(zhì)量濃度的平均值，單位為毫克每毫升(mg/mL)。
6
7 結(jié)果評價
7.1 定性分析結(jié)果評價
7.1.1 頂空氣相色譜法定性結(jié)果評價
陽性結(jié)果評價：在相同條件下進(jìn)行樣品測定時，檢材樣品中目標(biāo)物的色譜峰保留時間與添加樣品一致(相對誤差在士1%之內(nèi)),空白樣品無干擾，且經(jīng)選用不同性質(zhì)的色譜柱進(jìn)行分析，結(jié)果一致，則可判斷檢材樣品中檢出目標(biāo)物。乙醇等6種化合物及內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜圖見附錄 A 中 圖 A.1～ 圖 A.4。陰性結(jié)果評價：檢材樣品未出現(xiàn)與添加樣品目標(biāo)物一致的色譜峰，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中未檢出目標(biāo)物。
7.1.2 頂空氣相色譜-質(zhì)譜法定性結(jié)果評價陽性結(jié)果評價：在相同條件下進(jìn)行樣品測定時，檢材樣品中目標(biāo)物的色譜峰保留時間與添加樣品一致(相對誤差在±1%之內(nèi)),且在扣除背景后的檢材樣品質(zhì)譜圖中，目標(biāo)物特征碎片離子(不少于3個)與添加樣品一致，離子豐度比與濃度接近的添加樣品相比，相對誤差不超過表2規(guī)定的范圍，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中檢出目標(biāo)物。陰性結(jié)果評價：檢材樣品未出現(xiàn)與添加樣品目標(biāo)物一致的色譜峰，空白樣品無干擾，則可判斷檢材樣品中未檢出目標(biāo)物。
7.2 定量分析結(jié)果評價
兩份檢材樣品中目標(biāo)物含量的相對相差不大于1 0 % (有凝血的血樣不大于1 5 % ) ,定量數(shù)據(jù)可靠，其含量按兩份檢材的平均值計算。檢材樣品中目標(biāo)物含量的相對相差大于10%(有凝血的血樣大于15%),定量數(shù)據(jù)不可靠，應(yīng)按6.2重新測定。
乙醇和甲醇中毒參考資料見附錄 B 和附錄
附 錄 A
(資料性)
血液、尿液中乙醇等化合物的氣相色譜圖、校準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限
A.1 乙醇等6種化合物及內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜圖
乙醇等6種化合物及內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜圖見圖 A.1～ 圖 A.4。
標(biāo)引序號說明：
1——甲醇(1.154 min);
2——乙醇(1.450 min);
3——異丙醇(1.755 min);
4——叔丁醇(2.069 min);
5——正丙醇(2.310 min);
6——丙酮(2.542 min);
7——正丁醇(4.458 min)。 圖 A.1 在色譜柱(1)參考條件下乙醇等6種化合物及內(nèi)標(biāo)物的氣相色譜圖
A.2 乙醇的參考校準(zhǔn)曲線
配制乙醇質(zhì)量濃度為0.10 mg/mL、0.20 mg/mL、0.50 mg/mL、0.80 mg/mL、1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、3.00 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按6.2分析，以乙醇與內(nèi)標(biāo)物叔丁醇的峰面積比(Y) 為縱坐標(biāo)、乙醇質(zhì)量濃度(w) 為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。得線性回歸方程 Y=1.2409w—0.0462 (色譜柱1) ,Y=1.216 lw-0.0578(色譜柱2) ,Y=1.0307w-0.0276 (色譜柱3) ,Y=1.0287w-0.013 (色譜柱4) ,r 均不小于0.997。
若檢材樣品的濃度超出線性范圍，需用水稀釋檢材樣品或重新制作校準(zhǔn)曲線，使檢材樣品的濃度在校準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)。
A. 3 檢出限和定量限
本文件的 HS/GC 方法檢出限除正丙醇為0.005 mg/mL 外，其余化合物均為0.05 mg/mL; 定量限均為0.10 mg/mL。
本文件的 HS/GC-MS 方法檢出限均為0.05 mg/mL。
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