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PCR技術(shù)可用于：（1）檢驗感染性疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)；（2）有效檢測癌基因的突變，準確檢測癌基因的表達量；（3）臨床應(yīng)用于檢測地中海貧血的基因突變。
實驗方法
- PCR技術(shù)
| 實驗方法原理 | PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。 PCR由變性--退火--延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成： ①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準備； ②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合； ③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈。 重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 |
|---|---|
| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 展開 |
| 注意事項 | 1. 由于PCR反應(yīng)靈敏度很高，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中。 2. 如果是公用的、沒有密碼保護的PCR儀，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否。 3. 不使用過量試劑“less is usually better （more specific）”。 4. 試劑購回后應(yīng)分裝成小份使用，這樣一旦有污染發(fā)生，可以立即丟棄污染的試劑，不會造成大的損失；試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)（例如dNTPs對反復(fù)凍融敏感）。 5. 加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。 6. 使用陰性對照檢查污染的發(fā)生。 7. 使用陽性對照（能良好擴增的樣本）。 8. 電泳時使用DNA分子量標(biāo)準品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失?。?。 9. 當(dāng)擴增很長的、GC含量高的模板時或容易產(chǎn)生二級結(jié)構(gòu)的模板時適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用；DMSO 減少二級結(jié)構(gòu)的發(fā)生，并通過減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性）。 10. 不使用帶有自動除霜功能的冰箱存儲酶（避免反復(fù)凍融），每次取酶時都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱。酶要在加完緩沖液后再加，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。 11. PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間，一般為48 h以內(nèi)，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。 |
| 其他 | 一、 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié) 1. 模板核酸的制備。 2. 引物的質(zhì)量與特異性。 3. 酶的質(zhì)量。 4. PCR循環(huán)條件。 二、 PCR常見問題及對策 1. 假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 （1）模板原因 ① 模板中含有雜蛋白質(zhì)。 ② 模板中含有Taq酶抑制劑。 ③ 模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。 ④ 在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。 ⑤ 模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。 （2）酶失活 ① 需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。 ② 忘加Taq酶或溴乙錠。 （3）引物 ① 引物質(zhì)量。 ② 引物的濃度。 ③ 兩條引物的濃度是否對稱。 解決對策： ① 選定一個好的引物合成單 位。 ② 引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。 ③ 引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。 ④ 引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 （4）Mg2+濃度 ① 濃度過高降低PCR擴增的特異性。 ② 濃度過低影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。 （5）反應(yīng)體積的改變 ① 通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定; ② 在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。 （6）物理原因 ① 變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。 ② 退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。 ③ 擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題。 （7）靶序列變異 ① 靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。 ② 靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。 2. 假陽性，出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。 （1）引物設(shè)計不合適 ① 選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性。 ② 靶序列太短或引物太短。 （2）靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染 ① 整個基因組或大片段的交叉污染。 解決方案：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。 ② 空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生。 解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除。 3. 出現(xiàn)非特異性擴增：PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。 （1） 引物與靶序列不*互補或引物聚合形成二聚體。 （2） Mg2+離子濃度過高。 （3） 退火溫度過低。 （4） PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。 （5） 酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。 其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。 4. 出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 （1）原因 ① 酶量過多。 ② 酶的質(zhì)量差。 ③ dNTP濃度過高。 ④ Mg2+濃度過高。 ⑤ 退火溫度過低。 ⑥ 循環(huán)次數(shù)過多引起。 （2）對策 ① 減少酶量。 ② 調(diào)換另一來源的酶。 ③ 減少dNTP的濃度。 ④ 適當(dāng)降低Mg2+濃度。 ⑤ 增加模板量。 ⑥ 減少循環(huán)次數(shù)。 |
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實驗心得
wsgcc: 空質(zhì)粒ppiczA電轉(zhuǎn)GS115后PCR篩選遇難題
我想有300多bp的片段出現(xiàn)，說明酵母細胞已經(jīng)破碎（用的溶細胞酶），奇怪的是2.2KB的條帶去哪里了？是PCR假陰性呢，還是菌落都是假陰性呢？唉!本來準備篩選出來好好過五一，看來計劃趕不上變化了。各位老師，請幫幫我吧!不勝感激！
發(fā)表于2005-11-17
一天P幾百管的人可能不用擔(dān)心條帶有沒有，而對于剛?cè)腴T分子生物學(xué)的人來說，PCR能看到條帶，能看到一條明亮的帶就是入門zui大的欣慰。師姐會告訴你，引物設(shè)計很重要，不能有二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)；師兄也會和你說退火溫度很重要。提高PCR特異性可謂是仁者見仁，智者見智。搜集了丁香園里網(wǎng)友們的討論，精華匯總?cè)缦隆?/p>
發(fā)表于2006-07-13 10:50
sinviolet: 質(zhì)粒載體能否做PCR進行擴增？
首先，要看你的載體是環(huán)狀的（如ET32a）還是線性的（如pMD-T）.要是環(huán)狀的就找合適的宿主轉(zhuǎn)化再提出來就可以持續(xù)用了。要是線性的就不能這樣做了。PCR的話首先要合成引物，還不能保證高保真性好，要確認的話還要測序，所以總的下來從時間和經(jīng)濟上考慮是不劃算的。
發(fā)表于2007-04-28 20:42
