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枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備實(shí)驗(yàn)

2013-3-2　　閱讀(2220)

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標(biāo)簽：枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備

枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備可以：（1）用于建立枯草芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系；（2）用于其基因改造；（3）用于提高枯草芽孢桿菌生產(chǎn)性能相關(guān)研究。

實(shí)驗(yàn)方法

化學(xué)法
化學(xué)改進(jìn)法

實(shí)驗(yàn)材料	枯草芽孢桿菌168
試劑、試劑盒	SPI 培養(yǎng)基 EGTA SPII 培養(yǎng)基檸檬酸鈉 EGTA 氫氧化鈉 KH2PO4 K2HPO4 MgCl2 MgSO4 葡萄糖酵母膏（ NH4 ）2SO4
儀器、耗材	培養(yǎng)箱培養(yǎng)皿錐形瓶紫外分光光度計(jì) 接種環(huán) 離心管
實(shí)驗(yàn)步驟	一、試劑配制 1. SP 鹽 0.2%（ NH₄ ）₂SO₄，1.4% K₂HPO₄，0.6% KH₂PO₄， 0.02% MgSO₄·7H₂O， 0.1% 檸檬酸鈉。 2. CAYE （100×） 2 % Casamino acid，10%酵母膏。 3. SPI 培養(yǎng)基 SP 鹽溶液加入1 %體積濃度為50%葡萄糖溶液，1 %體積100×CAYE 溶液。 4. SPII 培養(yǎng)基 SPI 培養(yǎng)基加入1 %體積50 mmol/L CaCl₂ 溶液，1 %體積250 mmol/L MgCl₂ 溶液。 5. SP-A Salts Solution（500 ml）（1）0.4% （NH₄）₂SO₄ ：2 g （2）2.8% K₂HPO₄·3H₂O ：14 g （3）1.2% KH₂PO₄ ：6 g （4）0.2% Trisodium Citrate Dihydrate ：1g （5）121°C滅菌20 min。 6. SP-B Salts Solution（500 ml）（1）0.04% MgSO₄·7H2O： 0.2 g （2）121°C滅菌20 min。 7. 100×CAYE Solution（100 ml）（1）2% Casamino acid ：2 g （2）10% Yeast Extract：10 g （3）121°C滅菌20 min。 8. SPI Medium（20 mL） SP-A Salts Solution：9.8 mL SP-B Salts Solution：9.8 mL （1%V）Glucose（50%w/v，115°C滅菌20 min）：200 μL （1%V）100×CAYE：200 μL 10. SPII Medium（6 mL） SPI Medium：5.88mL （1%V）50mM CaCl₂ ：60μL （1%V）250mM MgCl₂：60μL 11. 100×EGTA Solution 10mmol/L EGTA 溶液，溶解時(shí)需加少量NaOH 至pH8.0。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 準(zhǔn)備新鮮的168 單克隆平板，取一滿環(huán)枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB 平板，37°C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。 2. 轉(zhuǎn)化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)過夜。 3. 第二天上午取160 μl 培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至8 ml SPI 培養(yǎng)基中，37°C，250 r/min 培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期（168 約4-5 h）。 4. 取0.2 ml 生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期末的培養(yǎng)液至2 ml SPII 培養(yǎng)基中，37 °C，100 r/min 培養(yǎng)90 分鐘。 5. 在上述SPII培養(yǎng)基的菌體中加入20 μl 10mmol/L EGTA，再于37°C，100 r/min 培養(yǎng)10 分鐘。 6. 將上述處理后的菌液分裝成0.5 ml 每管，各加入5 μl DNA（DNA 量不能過高，不超過5 μg），再于37 °C，250 r/min 培養(yǎng)90 分鐘，取菌液涂布篩選平板。收起
注意事項(xiàng)	1. 注意儀器用品的干凈和無菌。 2. 8ml SPI 培養(yǎng)基要放于50 ml 離心管中培養(yǎng)，以保證菌體的生長(zhǎng)狀態(tài)，不要使用玻璃試管。 3. 注意測(cè)定OD值，一定要等菌體生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后期。 4. 保證菌體的濃度，可以提高轉(zhuǎn)化率。展開

實(shí)驗(yàn)方法原理	用GM I和GM II溶液處理枯草芽孢桿菌野生型菌株BS501a，用改進(jìn)的方法制備感受態(tài)細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)材料	野生型枯草芽孢桿菌菌株BS501a
試劑、試劑盒	Spizizen salts母液 CaCl2 氨基酸 GM II培養(yǎng)基 GM I培養(yǎng)基MgCl2 酵母粉 K2HPO4·3H2O 水解酪蛋白葡萄糖檸檬酸鈉蒸餾水 KH2PO4 MgSO4
儀器、耗材	微孔濾膜離心機(jī) 錐形瓶離心管滅菌鍋搖床
實(shí)驗(yàn)步驟	一、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備 1. 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備用貯存液（1）10×Spizizen salts母液： 15% K₂HPO₄·3H₂O，6% KH₂PO₄，2% （NH₄ ） ₂SO₄，0.2% MgSO₄，1% 檸檬酸鈉，溶于蒸餾水中，6.6 ×10⁴ Pa高壓滅菌，室溫貯存。（2）10% 酵母粉、1% 水解酪蛋白和25 mmo l /L MgCl₂， 6.6 ×10⁴ Pa高壓滅菌，酵母粉溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，水解酪蛋白和 MgCl₂溶液可室溫貯存；20%葡萄糖、0.25% 所需氨基酸和0.1 mo l/L CaCl₂，用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，葡萄糖溶液和CaCl₂ 溶液室溫貯存，氨基酸溶液- 20℃ 貯存。 2. 枯草芽孢桿菌感受態(tài)制備用培養(yǎng)基（1）GM I：1mL 10 ×Spizizen salts， 0.1 mL，10% 酵母粉，0.25 mL 20% 葡萄糖，0.2 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸，補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積10 mL。（2）GM II：1 mL 10×Spizizen salts，0.05 mL10%酵母粉， 0.25 mL 20% 葡萄糖，0.04 mL 1% 水解酪蛋白，0.2 mL 0.25%所需氨基酸， 0.05 mL 0.1mo l/L CaCl₂， 1 mL 25 mmo l/L MgCl₂，補(bǔ)充滅菌蒸餾水至總體積10mL。二、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 挑取一新鮮培養(yǎng)的野生型枯草芽孢桿菌菌株BS501a菌落接種于2.5 mL GMI培養(yǎng)基中，30℃，130-150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。 2. 將過夜培養(yǎng)物按10%接種量接種于2.5 mL新鮮的GM I中，37℃，200- 230 r/min振蕩培養(yǎng)3.5h。 3. 再將培養(yǎng)物進(jìn)行第二次傳代，接種于5 mL GMII培養(yǎng)基中，野生型菌株BS501a按5% 接種量進(jìn)行第二次傳代，37℃，200-230 r/min振蕩培養(yǎng)90 min。 4. 取1mL培養(yǎng)物，5 000 r/min室溫離心5 min，用1 /10體積上清液重新懸浮細(xì)菌沉淀，即為枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。展開

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實(shí)驗(yàn)心得

（共5個(gè)心得）

HR微生物: 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)

枯草芽孢桿菌培養(yǎng)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：假如你所希望生長(zhǎng)的細(xì)菌是革蘭氏陰性菌,那么我建議你用低濃度的紅霉素就能夠很好的把平板上面的芽孢桿菌抑制了。假如只是需要細(xì)胞壁碎片的話，那就用溶菌酶就好。

發(fā)表于2012-10-16 19:53
gdmc415: 如何判斷是否超聲*

如何判斷枯草芽孢桿菌是否超聲*，根據(jù)網(wǎng)友的經(jīng)驗(yàn)，一般有以下幾個(gè)方面： 1. 外觀判斷； 2. 液體的粘滯性； 3. 高速離心； 4. 染色。

發(fā)表于2009-10-10 21:14
Asonlopin: 如何去除基因工程菌?

基因工程菌在培養(yǎng)的過程中會(huì)消耗抗生素的，建議加大抗生素的用量，或者在發(fā)酵補(bǔ)料的時(shí)候適當(dāng)補(bǔ)加一些抗生

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