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          上海北諾生物科技有限公司
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           021-57730393
          
                        
          
                                                    
          
                                
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          傳真：
          
								
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          地址：
          
                              
          上海市徐匯區(qū)宜山路520號中華門大廈18樓D座
          
                            
          
                                                     
          
              
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                                        www.bnbiotech.com
              
          
          
          
                          
          
          
          網(wǎng)址：
          
          
          www.bnbiotech.com
          
        
          
            
        
          
            
          
            
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          流式胞內(nèi)染色實驗方法
          2013-4-24　　閱讀(2980)
          

          
							
				
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          方案A：兩步法胞內(nèi)（細胞質(zhì)）蛋白染色。
          方案B：一步法胞內(nèi)蛋白染色（細胞核）。
          注意：
          1、不同細胞因子的刺激條件是不同的，比如：LPS刺激活化單核細胞分泌IL-6的培養(yǎng)時間一般是6個小時，而檢測IL-10則需要刺激24小時。
          2、結(jié)合熒光的流式抗體應(yīng)在4度，避光儲存。
          3、使用抗體前請低速離心30秒，使貼壁抗體沉底。不建議斡旋混勻抗體，可用手指輕彈混勻。
          4、除非方案中注明，默認的抗體孵育方法是冰上或4度避光。
          5、緩沖液中加BSA或FBS可以減少固定破膜后的非特異性背景。

          方案A: 兩步法胞內(nèi)（細胞質(zhì)）蛋白染色
          實驗材料：
          12×75mm 圓底檢測流式管。
          [可選]可固定的活度染料eFluor® 450 （eBioscience Cat. No. 65-0863）, eFluor® 660 （eBioscience Cat. No. 65-0864），eFluor® 780 （eBioscience Cat. No. 65-0865）。
          胞內(nèi)抗原的直標抗體。
          IC Fixation Buffer （eBioscience Cat. No. 00-8222）。
          Permeabilization Buffer （10X） （eBioscience Cat. No. 00-8333）雙蒸水稀釋成1×。
          Flow Cytometry Staining Buffer （eBioscience Cat. No. 00-4222）（可以自己配置）。
          實驗流程： 
          1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
          2、按照流式表面染色方法標記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心*棄上清。斡旋分散細胞。
          3、加100ul IC Fixation buffer ，斡旋固定細胞。室溫避光孵育20min。
          4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
          5、300g 室溫離心5min,棄上清。
          6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。
          7、300g 室溫離心5min,棄上清。
          8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入二抗IL-17A （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。
          9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。
          10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。
          11、適量流式染色液重懸即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結(jié)果。

          方案B：一步法胞內(nèi)（細胞核）蛋白染色
          實驗材料：
          12×75mm 圓底檢測流式管。
          [可選]可固定的活度染料eFluor® 450 （eBioscience Cat. No. 65-0863）, eFluor® 660 （eBioscience Cat. No. 65-0864），eFluor® 780 （eBioscience Cat. No. 65-0865）。
          胞內(nèi)抗原的直標抗體。
          Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent （eBioscience Cat. No.00-5521）
          Permeabilization Buffer （10X） （eBioscience Cat. No. 00-8333）雙蒸水稀釋成1×。
          Flow Cytometry Staining Buffer （eBioscience Cat. No. 00-4222）（可以自己配置）。
          注意：
          Foxp3 Fixation/Permeabilization Concentrate 1份加3份 Diluent 稀釋為工作液（1:4稀釋）。
          實驗方案： 
          1、按照流式樣品要求制備單細胞懸液。
          2、按照流式表面染色方法標記CD3和CD4。緩沖液洗滌一次，離心*棄上清。斡旋分散細胞。
          3、加1ml Foxp3 Fixation/permeabilization 工作液，斡旋固定細胞。室溫或四度避光孵育30-60min（小鼠樣品zui長可以四度固定18小時）。
          4、每管加2ml 1×permeabilization buffer。
          5、300g 室溫離心5min,棄上清。
          6、2ml 1×permeabilization buffer重懸細胞。
          7、300g 室溫離心5min,棄上清。
          8、加100ul 1×permeabilization buffer 重懸細胞后，加入二抗FOXP3 （或其他胞內(nèi)抗原抗體），室溫避光孵育20min。
          9、2ml 1×permeabilization buffer洗一次，300g 室溫離心5min,棄上清。
          10、加2ml 流式染色液，300g 室溫離心5min,棄上清。
          11、適量流式染色液重懸，即可上機檢測。同行對照依照上述步驟進行。軟件分析結(jié)果。
          
      
          
      
      
          
    
          
    
          
  
          

          
		 







  
    
    				
			 
    
    

    

     
      
     
	 

 	
	
	


          
	
          
		
          
			
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