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物種的遺傳多樣性在本質(zhì)上是DNA 一級序列的多樣性。近年來，隨著DNA 測序技術(shù)的迅速發(fā)展和日益普及，DNA 測序在遺傳多樣性的研究中正在起著越來越大的作用。本章將介紹目前在遺傳多樣性研究中常用的一種手動和一種全自動雙鏈DNA 測序方法。
1 DNA 模板的制備
在遺傳多樣性的研究中，由于樣本量一般都較龐大，因而DNA 測序的速度就成了很關(guān)鍵的因素。因此，這類研究中常常直接測定純化的PCR 雙鏈產(chǎn)物而不大采用克隆技術(shù)。本節(jié)介紹本實驗室常用的從PCR 產(chǎn)物制備測序模板的方法，即低熔點膠回收法。
（1）制備1.5％～2.0％的瓊脂糖凝膠，待其充分凝固后，在離點樣線5cm 左右處切下寬約1cm 的膠條，在切出的槽中倒入預(yù)先煮沸的低熔點瓊脂糖膠。
（2）低熔點膠凝固后，將待純化的PCR 反應(yīng)液全部點樣，恒壓100V 左右進行電泳，直至擴增片段進入到低熔點膠中部。在360nm 紫外光下，將已進入低熔點膠的條帶切下，放入1．5ml離心管中。
（3）離心，將膠塊壓縮到管底，然后補加 TE 至 500μl。于 68℃水浴，將低熔點膠熔化，再迅速加入等體積的水飽和酚并混勻。
（4）室溫下振蕩抽提10 分鐘，再12 000r／min 離心 10 分鐘。取上清液再用氯仿-異戊醇（24:1）抽提5 分鐘。
（5）12 000r／min 離心 10 分鐘，取上清液，在其中加入 1／10 體積的 10 mol／dm3NH4Ac和2 倍體積的無水乙醇，置―70℃下沉淀半小時以上。
（6）再12 000r／min 離心 10 分鐘，沉淀用 70％的冷乙醇洗滌；再次短暫離心后小心地倒去乙醇液。沉淀干燥后，加入20～50μlTE 緩沖液或無菌去離子水中溶解，即為制好的DNA模板。
目前還有一些非常有效的商售試劑盒可用于純化 PCR 產(chǎn)物，如 Oiagen PCR 產(chǎn)物純化試劑盒等，但成本較高。
2 手動DNA 序列分析技術(shù)
2.1 測序膠的制備
按以下配方制備測序電泳膠：
6％膠工作液 70ml
10％過硫酸胺（APS） 70μl（新鮮配制）
TEMED 70μl
將上述溶液混合后，灌入準(zhǔn)備好的膠板中，將“鯊魚齒”梳子反插入膠，深約0.5～1.0cm。室溫下聚合1 小時左右。
2.2 測序反應(yīng)
測序試劑盒購自美國 USB 公司，測序酶為 Sequenase Version 2.0；α35S-dATP 購自美國
DuPont 公司（1mCui／100μl）。測序反應(yīng)按USB 推薦的方法進行：
（1）DNA 模板混合液（0．5ml Eppendorf 管）：
DNA 模板 7μl
測序引物 1μl
5 倍 Reaction buffer 2μl
NP4O 1μl
（2）標(biāo)記混合液（每一反應(yīng)的量）：
DTT（0.1mol／dm3） 1μl
1／5dGTP labelling mix 2μl
Enzyme dilution buffer 1.75μl
NP4O 0.55μl
去離子水 0.375μl
測序酶 0.125μl
35S-dATP 0.5μl
（3）ddNTP（ddA、ddG、ddC、ddT） 2.5μl
（4）退火反應(yīng)（annealing）：將DNA 模板混合液煮沸3 分鐘，迅速放入乙醇和干冰的混合冰浴箱中退火30 秒左右（如無干冰，則用冷凍于－20℃～－70℃下的無水乙醇，臨用前由冰箱中取出）。在進行標(biāo)記反應(yīng)之前，反應(yīng)液需保存于干冰或碎冰中。
（5）標(biāo)記反應(yīng)（labelling）：由干冰或冰中取出經(jīng)退火的DNA 模板混合液，放在手中使其融化，然后加入 5.5μl 的標(biāo)記混合液。在微型離心機上離心 10～15 秒后，置室溫中 1 分鐘。（6）鏈終止反（termination）：將上一步驟制成的混合液以每管3.3μl 分裝入預(yù)先在37℃下溫浴的加有ddNTP 的管中，并在37℃下反應(yīng)4～5 分鐘。
（7）每管加入4μl 終止液（stop solution）。
2.3 電泳
電極緩沖液 1 倍TBE（pH 值8.0）
預(yù)電泳 30 分鐘至1 小時
恒溫方式 測序膠板上夾蓋鋁恒溫板
電泳溫度 50℃左右
電泳條件 恒功率 90～110W
電泳時間 2.5 小時至5 小時
2.4 干膠制備和壓片
電泳結(jié)束后取下膠板，用工具撬開玻璃板，使膠留在其中一塊板上。將裁剪好的新華3 號濾紙在膠上貼緊，使膠粘在濾紙上，然后將膠放置于干膠器中制備干膠1～1.5 小時。制好的干膠放入壓片盒中，放于暗室中，將X 光片壓于膠上曝光2～3 天。
2.5 X 光片的沖洗
將曝光后的X 光片顯影4～8 分鐘（根據(jù)顯影液的使用時間長短而定）；定影5～10 分鐘，沖洗后即可讀取DNA 序列。
3 自動 DNA 序列分析技術(shù)
本節(jié)描述運用Perkin-Elmer 公司的373 和377 型全自動DNA 測序儀進行雙鏈DNA 測序的方法。熱循環(huán)測序反應(yīng)使用 Applied Biosystems Inc.的DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit（＃401434）或FS-DNA Sequencing Kit（＃402079）進行。操作過程主要根據(jù)廠家推薦的方法進行。具體操作方法如下。
3.1 混合反應(yīng)物
（1）取2.5μl 純化好的PCR 產(chǎn)物［相對于2.5μl 測序試劑盒中的pGEM-3Zf（＋）DNA］，進行瓊脂糖凝膠電泳。
（2）凝膠用溴化乙錠染色，用流水沖洗脫色后，在紫外光下進行照相記錄。參照pGEM-3Zf
（十）DNA 估測待測DNA 模板的濃度，以確定測序反應(yīng)中應(yīng)取的模板量。
（3）在一個標(biāo)記的 0.5ml Eppendorf 管中，混合以下反應(yīng)物：
DNA 模板 適量
引物（10pmol／ml） 0.5μl
加水至 5.25μl 或6.0μl（FSKit）
100℃下變性2 分鐘，再冰浴2 分鐘后短暫離心，然后加：
DyeDeoy TM Terminator Cycle Sequencing Kit 中測序液 4.75μl
或 FS-DNA Sequencing Kit 中測序液 4.0μl
終體積 10μl
（4）用微量取樣器將反應(yīng)物充分混合后，加 20μl 石蠟油覆蓋。
3.2 熱循環(huán)反應(yīng)
該反應(yīng)中降溫時間非常關(guān)鍵（約1℃／s）。因此，可使用Perkin-Elmer 序列的熱循環(huán)儀（PCR 儀，如 480，2400 或 9600）。以下所描述的操作均基于Perkin-Elmer Model 480 熱循環(huán)儀。將反應(yīng)管放入熱循環(huán)儀中，按以下程序進行熱循環(huán)反應(yīng)：
（1）96℃ 1 秒鐘
96℃ 30 秒鐘
（2）50℃ 1 秒鐘
50℃ 1 分鐘
（3）60℃ l 秒鐘
60℃ 4 分鐘
共需25 個循環(huán)。
3.3 純化測序產(chǎn)物
純化測序產(chǎn)物的方法是使用Princeton Separations Inc 的Centri SeP 柱（＃CS-901）。操作過程如下：
（1）輕彈柱，使Cephadex G-50 膠粉從柱底部揚起。
（2）移去柱上蓋，加入 800μl 去離子水，再蓋上蓋振蕩，以除去氣泡。
（3）在室溫下放置30 分鐘，以水化凝膠柱。
（4）移去柱上蓋和下蓋，將凝膠柱放入一個配置好的洗脫管中，讓多余液體流出。
（5）倒去液體，將柱連同洗脫管一起在 3 000r／min 下離心 2 分鐘。
（6）將柱放入一個1.5ml 離心管中，用微量取樣器將測序反應(yīng)物取出，注在凝膠柱中央。注意避免帶入石蠟油。
（7）3 000r／min 下離心 2 分鐘。應(yīng)注意柱的定向必須與*次離心時一致。
（8）將樣品放在真空干燥離心機中干燥。
（9）將干燥后的樣品貯存于―70℃下待進行電泳。在此條件下保存1 年之久的樣品其熒光也不會猝滅。
應(yīng)注意的是，Centri-sep 柱體可反復(fù)使用多次。每次使用過后，要用自來水洗3 次，蒸餾水洗 2 次，然后倒置于一試管架上晾干后，稱取 50mg Cephadex G-50（Sigma，＃9048719）放入其中，即可再行使用。
3.4 電泳
使用ABI 公司的377 型全自動DNA 序列分析儀電泳，并記錄序列數(shù)據(jù)?？刂栖浖镻RIM377 Collection。電泳過程如下。
（1）聚丙烯酚胺凝膠濃度為4.25％，配制過程如下：
尿素 18g
Amberlite 離子交換樹脂（Sigma，MB-lA） 約39g
40％Acry mide：Bis（19:1 ）（AMRESCO，＃0496-500） 5.3ml
去離子水 25ml
將混合液在電磁攪拌器上攪拌10 分鐘。
（2）取5ml 10 倍TBE，通過2μm 濾膜抽濾后，再抽濾以上膠液。
10 倍TBE 配方：
Tris-base 108g
硼酸 55g
Na2 EDTA（2H2O） 7.44g
定容至 1L
（3）將濾過液定容至 50ml，加入 35μl TEMED 和 250μl 10％過硫酸胺（APS），輕搖混合后，用50ml 無針頭注射器將膠注入已裝配好的玻璃板中。
（4）1 小時后，將膠安裝于全自動序列儀上預(yù)電泳 30 分鐘，恒壓1kv，并使溫度升至 51℃。
（5）預(yù)電泳的同時，取出 36 份―70℃下貯存的樣品，各加入5μl 載樣液（50μl 試劑盒中配備的loading buffer＋250μl 去離子甲酰胺，臨用前配制）。
（6）將混合液在旋渦混合器上振蕩，94℃下變性2 分鐘，冰浴2 分鐘后短暫離心。
（7）各取 1.5μl 點樣，恒壓 1.68kv 電泳 7 小時。機器將自動分析和記錄序列結(jié)果。常有電泳道識別錯誤的情況，此時應(yīng)人為修復(fù)。
來源：儀器交易網(wǎng) http://www.yi7.com/com_beinuo/news/itemid-33578.html