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          DNA實驗技術(shù):細(xì)菌中制備基因組DNA實驗

          2013-8-22  閱讀(1013)

          分享:

          標(biāo)簽: 細(xì)菌 基因 DNA

          真核生物的一切有核細(xì)胞(包括培養(yǎng)細(xì)胞)都能用來制備基因組 DNA。真核生物的DNA是以染色體的形式存在于細(xì)胞核內(nèi),因此,制備DNA的原則是既要將DNA與蛋白質(zhì)、脂類和糖類等分離,又要保持DNA分子的完整。

          實驗方法
          • 小量制備
          • 氯化銫法
          實驗方法原理 提取DNA的一般過程是將分散好的組織細(xì)胞在含SDS(十二烷基硫酸鈉)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白質(zhì),再用酚和氯仿/異戊醇抽提分離蛋白質(zhì),得到的DNA溶液經(jīng)乙醇沉淀使DNA從溶液中析出。
          實驗材料
          試劑、試劑盒
          儀器、耗材
          實驗步驟
          1.  培養(yǎng)100 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài),用JA-20轉(zhuǎn)子4 000 g 離心10 min。

          2.  用9.5 ml 的TE緩沖液重懸沉淀。

          3.  加0.5 ml 10%的SDS和50 μl 20 mg/ml 的蛋白酶K,混合,于37℃溫育1 h。

          4.  加1.8 ml 5 mol/l NaCl,充分混合,加入1. 5 ml CTAB/NaCl溶液,混合,于65℃溫育20 min。
           
          5.  加等體積的氯仿/異戊醇抽提,室溫下6 000 g 離心10 min,用寬口吸管將上清液轉(zhuǎn)移至新管中。
           
          6.  加化6體積的異丙醇,輕輕混合直至沉淀下來,用一個封口的巴斯德吸管將沉淀轉(zhuǎn)移至70%乙醇中冼滌。
           
          7.  10 000 g 離心5 min,棄上清,用4 ml TE緩沖液重懸沉淀。

          8.  用分光光度計檢測DNA的濃度,將其調(diào)節(jié)到50~100 μg/ml。

          9.  每4 ml 緩沖液加人4.3 g CsCl,并使之溶解,加入200 μl 的10 mg/ml 的溴化乙錠。

          10.  轉(zhuǎn)移至4 ml 快封口離心管中,調(diào)節(jié)體積,用TE緩祌液配制的CsCl平衡離心管,封住管口。

          11.  用VTi80轉(zhuǎn)子于15℃,以420 000 g 離心4 h或 250 000 g。
           
          12.  在長波紫外燈下觀察梯帶,用15號針頭和3 ml 塑料注射器移出條帶。

          13.  用CsCl飽和的異丙醇或水飽和的丁醇離心抽提,以除去溴化乙錠。

          14.  在2 L TE緩沖液中透折以除去CsCl,如果必要,沉淀DNA并重新溶解至所需要的濃度。

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