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脈沖場凝膠電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的,可分離長至5Mb的DNA分子,其工作原理是DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應所需的時間取決于它的大小。較小的分子重新定向較快,因而在凝膠中移動也較快,于是不同大小的分子被成功分離。
實驗方法
- 倒轉電場
實驗材料 | DNA |
---|---|
試劑、試劑盒 | GTBE TBE 瓊脂糖 |
儀器、耗材 | 電泳儀 |
實驗步驟 | 1. 制備用于水平電泳的1%瓊脂糖凝膠,放入電泳裝置,其上覆蓋以2~3 mm 的GTBE或TBE緩沖液。 2. 加入液體樣品。裝好蠕動泵用于電泳緩沖液循環(huán)。 3. 對于微型凝膠調整循環(huán)速度至5~10ml/min 對于大型凝膠則用20~50 ml/min。 4. 將管端與凝膠槽中的再循環(huán)口相連,或直接放入緩沖液槽。 5. 將可編程的轉換裝置與恒壓直流電源相連,然后將凝膠裝置與轉換裝置相連(見下表),開始電泳直到溴酚藍遷移1 cm,開啟轉換裝置及蠕動泵。 6. 與標準的瓊脂糖凝膠一樣進行溴化乙錠染色及照相。經(jīng)酸處理使DNA脫嘌呤后,凝膠可進行Southern雜交。 (1)這些公式假定使用0.5×TBE緩沖液;對于GTBE和TAE緩沖液,分離的片段將稍大,并且電泳速度分別要快約20%和30%。 (2)變量:T,溫度(℃);V,電場通度(V/cm);A,瓊脂糖百分濃度(對于脈沖場級瓊脂糖乘以0.8);脈沖時間(對于倒轉電場凝膠指反向時間,單位s);R,正向與反向電泳時問比率;θ,改向角度。 (3)倒轉電場凝膠不能分離此范圍以外的長度,變角度凝膠可以分離此范圍以外的片段,且效果不是很好。 |