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        1. 上海北諾生物科技有限公司

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          感受態(tài)專(zhuān)題:電穿孔轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli TG1細(xì)胞的制備

          2013-11-6  閱讀(1010)

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          材料和試劑

          1. 恒溫旋轉(zhuǎn)式搖床

          2. 三角燒瓶(容量為1或2L)

          3. 50ml滅菌離心管

          4. 低溫高速離心機(jī)

          5. SB培養(yǎng)基

          細(xì)菌培養(yǎng)用胰化蛋白胨     20g
                 細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物      5g
                 NaCl                     0.5g
                 去離子水                 950ml
                 250mmol/L KCl溶液        10ml

          以5N的NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.0,加去離子水至1L,高壓蒸氣滅菌。

          6. 20%葡萄糖溶液

          7. 1mol/L MgCl2溶液

          8. 10%甘油

          操作步驟

          1. 從新鮮的LB平板培養(yǎng)物中挑選一個(gè)TG1克隆,接種于10m1 SB培養(yǎng)基中。

          2. 37℃搖床培養(yǎng)過(guò)。

          3. 取2.5ml培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于0.5L SB中,另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。

          4. 37℃培養(yǎng)直到OD600=0.7~0.8。

          5. 將培養(yǎng)物置于冰浴15min,然后4000r/min于4℃離心20min,棄上清。

          6. 將菌體重懸于1/2體積的預(yù)冷10%甘油中,4000r/min于4℃離心20min,棄上清。

          7. 重復(fù)第(6)步驟。

          8. 將菌體重懸于15ml 10%甘油,并轉(zhuǎn)移至一支50ml的離心管中。3500r/min于4℃離心15min。小心地去掉上清,得到4~5ml細(xì)菌。迅速地將其吹打重懸;

          9. 分裝成200μl或40μl 的小份,操作應(yīng)在乙醇/干冰浴中進(jìn)行。貯存于-70℃。

          10. 用pUC19質(zhì)粒測(cè)試制備感受態(tài)細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率,應(yīng)達(dá)到109cfu/μg DNA。

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