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1 樣品RNA的抽提

①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解。

②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無(wú)色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次，使其*溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2 RNA質(zhì)量檢測(cè)

1）紫外吸收法測(cè)定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋?zhuān)?:100）后，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測(cè)定

A260下讀值為1表示40 ?g RNA/ml。樣品RNA濃度（?g/ml）計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 ?g/ml。具體計(jì)算如下：

RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495?l的TE中，測(cè)得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l

取5ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 ?l，剩余RNA總量為：

35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g

②純度檢測(cè)

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8到2.1。

2）變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

①制膠

1g瓊脂糖溶于72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液（12.3 M）。

10×MOPS電泳緩沖液

濃度  成分

0.4M  MOPS，pH 7.0

0.1M  乙酸鈉

0.01M  EDTA

灌制凝膠板，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 ?l溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

②準(zhǔn)備RNA樣品

取3?gRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10?g/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔。5-6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2-3cm。

④紫外透射光下觀察并拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定于用于抽提RNA的物種類(lèi)型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。

3 樣品cDNA合成

①反應(yīng)體系

序號(hào)  反應(yīng)物  劑量

1  逆轉(zhuǎn)錄buffer  2μl

2  上游引物  0.2μl

3  下游引物  0.2μl

4  dNTP  0.1μl

5  逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV  0.5μl

6  DEPC水  5μl

7  RNA模版  2μl

8  總體積  10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因（β-actin）實(shí)時(shí)定量PCR

①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備 陽(yáng)性模板的濃度為1011，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋?zhuān)铀?7μl并充分混勻）為1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104，以備用。

②反應(yīng)體系如下：

標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系

序號(hào)  反應(yīng)物  劑量

1   SYBR Green 1 染料  10μl

2  陽(yáng)性模板上游引物F  0.5μl

3  陽(yáng)性模板下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  陽(yáng)性模板DNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  總體積  50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應(yīng)體系：

序號(hào)  反應(yīng)物  劑量

1  SYBR Green 1 染料  10μl

2  內(nèi)參照上游引物F  0.5μl

3  內(nèi)參照下游引物R  0.5μl

4  dNTP  0.5μl

5  Taq酶  1μl

6  待測(cè)樣品cDNA  5μl

7  ddH2O  32.5μl

8  總體積  50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

③制備好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃　2分鐘，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個(gè)循環(huán)。

5 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線的DNA模板

①針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

反應(yīng)體系：

序號(hào)  反應(yīng)物  劑量

1  10× PCR緩沖液  2.5 ul

2  MgCl2 溶液  1.5 ul

3  上游引物F  0.5 ul

4  下游引物R  0.5 ul

5  dNTP混合液  3 ul

6  Taq聚合酶  1 ul

7  cDNA  1 ul

8  加水至總體積為  25ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個(gè)PCR循環(huán)（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72?C延伸5分鐘。

②PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010，依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個(gè)濃度梯度。

6 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR

①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系。

體系配置如下：

序號(hào)  反應(yīng)物  劑量

1  SYBR Green 1 染料   10 ul

2  上游引物  1ul

3  下游引物  1ul

4  dNTP   1ul

5  Taq聚合酶  2ul

6  待測(cè)樣品cDNA  5ul

7  ddH2O   30ul

8  總體積  50 ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)，zui后72℃7分鐘延伸。

7 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表

引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補(bǔ)；引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；引物不在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA 聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。

8 電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView?染色，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。