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4，洗脫方式的選擇,
離子交換色譜洗脫方式有三種：一是改變緩沖液pH，使蛋白質(zhì)從吸附狀態(tài)變?yōu)榻馕綘顟B(tài)。如在陰離子交換色譜中，通過降低流動相pH使吸附在柱子上的帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)帶正電，從而達(dá)到解吸附，在陽離子交換色譜中則是通過升高流動相pH的方法達(dá)到解吸附；二是增加緩沖液的離子強(qiáng)度，將吸附強(qiáng)的分子從離子交換劑上替換下來；三是緩沖液pH和離子強(qiáng)度同時(shí)改變。無論哪一種方法，都可用階段洗脫和梯度洗脫兩種方式進(jìn)行。
階段洗脫是用幾個(gè)不同pH緩沖液或幾個(gè)不同鹽濃度的緩沖液逐步進(jìn)行洗脫。即pH和離子強(qiáng)度變化不連續(xù)。而在梯度洗脫中，緩沖液的洗脫能力是連續(xù)增加的，由于后者分辨率更好，因此被廣泛采用。
在經(jīng)典色譜中需用梯度混合器來制造線性梯度，梯度混合器是由兩個(gè)容器構(gòu)成，兩個(gè)容器安放在同一個(gè)水平上，一個(gè)盛起始緩沖液，另一個(gè)盛含較高離子強(qiáng)度或不同pH的緩沖液。二者用管子相連，以保持溶液的流體靜力平衡。當(dāng)緩沖液從*個(gè)容器流入柱內(nèi)，第二個(gè)容器的緩沖液進(jìn)入*個(gè)容器自動補(bǔ)足，使緩沖液形成梯度。
現(xiàn)在許多中低壓色譜儀器（如Waters，Pharmacia等公司的一些產(chǎn)品）和液相色譜一樣可以用計(jì)算機(jī)控制雙泵自動配制流動相，很容易地獲得直線或非直線、連續(xù)或非連續(xù)的梯度模式，以滿足不同的分離需要。
通常對線性梯度的要求是：
（1）洗脫液的總體積應(yīng)足夠大，一般梯度至少要四倍床體積，使分離的各個(gè)峰有較好的分辨率；
（2）梯度上限要有足夠強(qiáng)的洗脫能力，使吸附的zui緊密的物質(zhì)也能夠從柱子上被洗脫下來；
（3）梯度的斜率不應(yīng)太大，以確保各峰能夠分開，但又不應(yīng)太小，以免峰形過寬甚至形成拖尾；一般認(rèn)為，梯度體積越大，梯度變化越緩，則分辨率越好。
（1）洗脫液的總體積應(yīng)足夠大，一般梯度至少要四倍床體積，使分離的各個(gè)峰有較好的分辨率；
（2）梯度上限要有足夠強(qiáng)的洗脫能力，使吸附的zui緊密的物質(zhì)也能夠從柱子上被洗脫下來；
（3）梯度的斜率不應(yīng)太大，以確保各峰能夠分開，但又不應(yīng)太小，以免峰形過寬甚至形成拖尾；一般認(rèn)為，梯度體積越大，梯度變化越緩，則分辨率越好。
實(shí)驗(yàn)操作
1．填料的預(yù)處理
2．裝柱
離子交換色譜不同于凝膠色譜，柱子通常較為短小，對于一般工作，通常選長度為10-40cm的柱已足夠。柱的直徑按照欲分物質(zhì)的數(shù)量來選定。對于很復(fù)雜的混合物和進(jìn)行精細(xì)分析是用細(xì)長的柱，分辨率較好；對于初步分離可用較粗、容量較大的柱。裝好的柱子用起始緩沖液充分平衡后上樣。
3．上樣
離子交換色譜柱必須充分平衡后方可上樣。上樣量取決于色譜柱的交換容量，一般為交換容量的70-80%，上樣體積可以不受限制。通常低濃度樣品上樣可達(dá)床體積的幾倍到幾百倍。這一點(diǎn)對較稀的樣品極為有利，可以同時(shí)起到分離和濃縮的雙重作用，可謂一舉兩得。但用于分析時(shí)，為了提高分辨率，上樣量體積適當(dāng)減小。用于離子交換色譜分離的樣品溶液的離子強(qiáng)度和pH值必須與起始緩沖液（即流動相A液）一致，如不一致，應(yīng)進(jìn)行緩沖液轉(zhuǎn)換，可通過透析或凝膠色譜來完成。
4．洗脫、樣品收集
加樣后用足夠量的起始緩沖液洗滌除去不吸附的物質(zhì)，然后再進(jìn)行洗脫。洗脫可選擇不同的方法，用控制器或梯度混合器控制梯度。流出的樣品組分經(jīng)紫外檢測器實(shí)時(shí)檢測（檢測波長一般為280nm），用分部收集器或手工收集。
5．再生
樣品洗脫完畢后要進(jìn)行再生，以除去仍然結(jié)合在柱子上未*洗下的一些蛋白質(zhì)，通常用100%流動相B液再洗脫1個(gè)柱體積即可。
6. 平衡
再生后的柱子欲再次進(jìn)樣需重新進(jìn)行平衡，平衡一般用100%A液（即0%B液）洗滌柱子至少四個(gè)柱體積。
7．保存
柱子不用時(shí)應(yīng)用強(qiáng)洗脫劑洗去結(jié)合于柱子上的雜質(zhì)，然后再用蒸餾水*清洗后加抑菌劑保存。
