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根據(jù)抗原-抗體相互作用的原理從群體中選出目的物的技術(shù)。如用抗體檢測表達(dá)型的基因文庫所合成的蛋白質(zhì)，從而篩選出目的基因的克隆。
實驗方法
- 基本方案
| 實驗材料 | cDNA |
|---|---|
| 試劑、試劑盒 | BHI 氯霉素 NaOH SSC 氯仿 異戊醇 TES SDS mRNA 甲硫氨酸 乙醇 乙酸鈉 免疫沉淀緩沖液 |
| 儀器、耗材 | 轉(zhuǎn)子 硝酸纖維濾膜 離心管 微量多孔洗滌儀 |
| 實驗步驟 | 1. 往微量滴定板的每孔中加入250 μl 含適當(dāng)抗生素的選擇性BHI培養(yǎng)液，并分別接種獨立的cDNA克隆，37℃溫育過。 2. 在250 ml 燒瓶中加入50 ml BHI/抗生素培養(yǎng)液，以10個克隆過培養(yǎng)液為一組， 從每個微孔中取100 μl 培養(yǎng)液，混合后接種到燒瓶中。 3. 37℃培養(yǎng)至A590=0.7，然后加入氯霉素繼續(xù)于37℃溫育過；對每組10個過的克隆重復(fù)培養(yǎng)。 4. 2 000 g 4℃離心10 min，制備質(zhì)粒DNA。 5. 將制得的約50 μg 質(zhì)粒DNA溶于1.5 ml TE緩沖液中，移入15 ml無菌、帶蓋的玻璃培養(yǎng)管中。 6. 沸水浴10 min立即加入1.5 ml 1 mol/l NaOH，室溫放置10 min。 7. 加 9 ml 中和液，混勻后置于冰浴，檢測pH只值應(yīng)在6.5~7.5之間。 8. 將0.45 μm 孔徑的硝酸纖維素濾膜放在一個連于真空泵的多孔濾器上。 9. 以1 ml/min 的速率加入第4步得到的變性DNA液，待所有液體被吸干后繼續(xù)抽吸3 min。 10. 取出濾膜用50 ml 6×SSC洗滌，然后于80℃真空烤箱中烤膜2 h。 11. 用無菌的單孔打孔器在濾膜上打出直徑為5 mm 的圓形小塊濾膜，分別用圓珠筆作好標(biāo)記。 12. 將盛于無菌帶蓋的塑料管的含10~50 μg poly（A）+ RNA的0.3 ml 雜交液在70℃預(yù)熱10 min。 13. 然后將10片小濾膜放入雜交液中，在50℃溫育2 h。 14. 將小濾膜轉(zhuǎn)移到50 ml 的試管（每管zui多可裝20片膜）中，每次用225 ml TES/0.5%SDS冼液于65℃旋轉(zhuǎn)振蕩洗滌30 s，共10次，吸去上請。 15. 然后每次用25 ml TES液干65℃洗膜，共2次。 16. 將每片小濾膜分別轉(zhuǎn)移到無菌、硅化的1.5 ml 微量離心管中，每管加入0.3 ml 水、2 μl 10 mg/ml 的酵母tRNA。 17. 置沸水浴中變性60 s，立即置干冰或冷乙醇中速凍。 接著在室溫下解凍。 18. 用無菌針挑去濾膜，往每個微量離心管中加入150 μl 飽和酚和150 氯仿/異戊醇，混勻，離心后將水相轉(zhuǎn)移至無菌的微量離心管中。 19. 加入30 μl 3 mol/l 乙酸鈉和2 倍體積的無水乙醇，離心沉淀核酸15 min，用0.5 ml 乙醇洗滌一次后凍干。 20. 將此雜交選擇的RNA重懸于10 μl 水中。 21. 取5 μl 雜交選擇的RNA，加入10 μl 翻譯反應(yīng)混合物，其中含標(biāo)記的甲硫氨酸， 30℃溫育60 min。 22. 加入15 μl 免疫沉淀緩沖液和1 μl 未經(jīng)免疫的血清，室溫下溫育10 min。 23. 加入40 μl 蛋白質(zhì)A-Sepharose懸液，在室溫靜置30 min、離心2 min 后將上清移至另一個新的微量離心管中。 24. 加入1 μl 針對相關(guān)基因產(chǎn)物的多克隆抗體或單克隆抗體，于室溫下溫育10 min。 25. 加入40 μl 蛋白質(zhì)懸液，于室溫反應(yīng)30 min，離心棄上滑。 26. 依次用1 ml 免疫沉淀緩沖液、1 ml 高鹽免疫沉淀緩沖液和1 ml 水冼滌蛋白A-Sepharose微珠。 27. 用20 μl 2×SDS樣品緩沖液重懸沉淀，沸水浴10 min。 28. 將吸附在蛋白A-Sepharose微珠上的翻譯產(chǎn)物洗下來，離心后等分成15~20 ml 的小份進(jìn)行變性SDS-PAGE電泳。 29. 干膠并進(jìn)行放射自顯影曝光。 |
