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          細(xì)胞技術(shù)專題:大鼠乳鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)實驗

          2014-2-20  閱讀(1027)

          分享:

          標(biāo)簽: 大鼠 乳鼠 成骨細(xì)胞

          大鼠乳鼠成骨細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)可以:(1)獲得大鼠乳鼠成骨細(xì)胞;(2)用于骨修復(fù)的細(xì)胞學(xué)機制研究。

          實驗方法

          • 酶消化法
          實驗方法原理取材于出生2~3 d 小鼠顱骨,以含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),采用膠原酶消化法分離成骨細(xì)胞,并進(jìn)行細(xì)胞接種與傳代。采用膠原酶消化法分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞是一種可靠、簡便、快速的細(xì)胞原代分離培養(yǎng)方法。
          實驗材料

          SD大鼠

          試劑、試劑盒

          F12 *培養(yǎng)液 胰蛋白酶 Ⅱ型膠原酶 酒精

          儀器、耗材

          手術(shù)器械 磁力攪拌器

          實驗步驟一、實驗步驟


          1.  拉頸處死24 小時內(nèi)新生的SD大鼠,75%乙醇浸泡5 min,取出頭蓋骨,分離頂骨和額骨,冰生理鹽水液反復(fù)洗滌大鼠乳鼠顱蓋骨標(biāo)本除去脂肪組織及殘留血,放入另一盛有F12 *培基液的培養(yǎng)皿中再洗滌, 將顱骨剪成2~5 mm碎片,將洗滌過的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 預(yù)消化15 min,以清除纖維組織細(xì)胞,棄去上清液(其中主要含成纖維細(xì)胞)。


          2.  然后以0.1%  Ⅱ型膠原酶10 ml,在37℃環(huán)境中消化 20 分鐘,室溫下磁力攪拌消化20 分鐘。靜置數(shù)分鐘,收集消化液,室溫下以1200 rpm離心10 分鐘。去除上清液,用20% 胎牛血清的F12 培養(yǎng)液4 ml 懸 浮細(xì)胞,接種于75 ml 培養(yǎng)瓶中,補培養(yǎng)液8 ml 使每瓶液體量達(dá)到12 ml;對靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 分鐘、磁力攪拌消化15 分鐘、離心10 分鐘,將獲得的3 瓶細(xì)胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱,在5% CO2,95%空氣,37℃溫度下培養(yǎng),24 小時后可見細(xì)胞貼壁生長,胞質(zhì)開始伸展,換新鮮培養(yǎng)液,以后每隔48 小時換培養(yǎng)液(注:消化視具體情況而定,也可多消化 1 遍)。


          3.  原代培養(yǎng)一般接種后第7 天能長滿。傳代時,取生長良好、貼壁松緊適度的成骨細(xì)胞 1 瓶,棄去培養(yǎng) 液,傳代時先以 PBS 沖洗 2 遍,加 0.25%胰酶1 ml,室溫下消化3~5 分鐘,將胰蛋白酶液棄去,加 F12 培養(yǎng)液充分吹打8-10 分鐘。將已消化的細(xì)胞收集、合并,計數(shù);用 F12 *培基調(diào)節(jié)至細(xì)胞濃度為合適濃 度。一般取2-5 代成骨細(xì)胞進(jìn)行實驗。代數(shù)太多,細(xì)胞老化或者分化明顯。
           

          二、結(jié)果

          如圖所示,成骨細(xì)胞的形狀和成纖維細(xì)胞非常相似,但是不同的是,比成纖維細(xì)胞更不容易消化,尤 其是傳代次數(shù)多,細(xì)胞老化的時候,非常難消化,并且不易消化成單個細(xì)胞。
           

          圖1:成骨細(xì)胞

          圖2:成骨細(xì)胞100倍
           

           
          圖3:成骨細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)

          三、鑒定的方法

          1.  堿性磷酸酶(ALP)活性檢測

          2.  骨玻璃樣蛋白(BGP)檢測

          3.  礦化結(jié)節(jié)檢測

          收起 
          其他一、討論
           

          成骨細(xì)胞包繞在硬組織中,致使處理困難,可采用骨組織塊法、酶消化法、骨膜組織塊法、 骨髓培養(yǎng)法以及薄層骨片經(jīng) EDTA 處理并經(jīng)膠原酶消化,均可培養(yǎng)出成骨細(xì)胞。體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞保持 有骨組織細(xì)胞的某些特征。據(jù)文獻(xiàn)報道,不同方法培養(yǎng)的成骨細(xì)胞形態(tài)是不同的[1]

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