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雄性新西蘭白兔

DMEM Ⅱ型膠原酶 α-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體 胎牛血清 胰蛋白酶 D-Hanks’液

飯盒 眼科直剪 眼科彎剪 眼科直鑷 眼科彎鑷 玻璃培養(yǎng)皿 廣口瓶 燒杯 錐形瓶 離心管 磁力攪拌器 攪拌子 目尼龍篩網(wǎng) 針式濾器

一、實(shí)驗(yàn)方法

1. 膀胱平滑肌細(xì)胞酶法分離

（1）肌注鹽200 mg 及氟哌利多5 mg 麻醉，待兔進(jìn)入麻醉狀態(tài)后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱組織。

（2）超凈臺(tái)內(nèi)依次慶大霉素溶液(濃度為100 單位/毫升)、生理鹽水及D-Hanks’液中浸泡洗滌 5 分鐘，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及漿膜層。

（3）肌肉剪成肉糜后0.1%Ⅱ型膠原酶(2 mg/mL) 溶液 40 過(guò)消化(約10-12 小時(shí))。

（4）然后加 0.25%胰蛋白酶 370 消化30 分鐘，消化液變混濁呈絮狀提示消化良好。

（5）用100 目細(xì)胞篩過(guò)濾該絮狀液，混懸液離心(1000  轉(zhuǎn)/分，離心半徑 13 cm) 5 分鐘，沉淀的細(xì)胞移入培養(yǎng)皿，加入含 10%胎牛血清的DMEM，置于50 mL/L CO₂、37℃飽和濕度孵育箱中靜置培養(yǎng)， 培養(yǎng)液每周更換 2-3 次。

2. 傳代培養(yǎng)

（1）待培養(yǎng)的細(xì)胞通過(guò)增殖達(dá)到約 80%匯合狀態(tài)時(shí)做傳代處理。

（2）棄去原培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)液，加入適量 的PBS(因培養(yǎng)液中的胎牛血清對(duì)胰蛋白酶有抑制作用)，輕輕搖動(dòng)，清洗殘留的培養(yǎng)液后棄之。

（3）加入適量的消化液，使其覆蓋整個(gè)細(xì)胞，將培養(yǎng)瓶放置于CO₂培養(yǎng)箱，不時(shí)在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞胞質(zhì)回 縮，胞間間隙增大后，吸出消化液，并向培養(yǎng)瓶中加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化。

（4）用吸管吸取培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁制備細(xì)胞懸液，吹打時(shí)不能用力過(guò)猛，盡量不出現(xiàn)氣泡，以免損傷細(xì)胞。

（5）細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，按照 1X10⁵~10⁶細(xì)胞/mL 密度將細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中。

3. 培養(yǎng)細(xì)胞的觀察及鑒定

兩只兔所有標(biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔 7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

均傳代順利，傳代后約正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 毫升培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

本組中均傳至第8 代，經(jīng)第8 次傳代后， 平滑肌細(xì)胞仍生長(zhǎng)迅速，未見(jiàn)衰老跡象。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)(圖1 中對(duì)照組2 周的 細(xì)胞；圖2 中實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2 周的細(xì)胞)。

細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型(見(jiàn)圖 3)。

電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)(圖 4)。

免疫組化染色檢測(cè)α-SMA 呈陽(yáng)性反應(yīng)(圖 5)。

從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè)α-SMA 呈陽(yáng)性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎99%。
 

 圖1. 對(duì)照組2周的細(xì)胞
 

圖2. 實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)2周的細(xì)胞
 

 
圖 3. 細(xì)胞爬HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞 ，細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型

圖4. 分離后培養(yǎng)細(xì)胞的電鏡檢查發(fā)現(xiàn)，平滑肌細(xì)胞致密斑結(jié)構(gòu)
 

 圖5. α-SMA免疫組化證實(shí)該方法能獲得單一膀胱平滑肌細(xì)胞(棕色為α-SMA陽(yáng)性) 
 

1. 應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作。

2. 仔細(xì)*剝除膀胱黏膜、黏膜下及漿膜層，是確保獲的大量高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。

3. 膀胱平滑肌組織應(yīng)盡量減碎以確保充分消化。

4. 嚴(yán)格控制膠原酶和胰蛋白酶的濃度和消化時(shí)間，見(jiàn)消化液混濁、組織塊呈絮狀，或在倒置顯微鏡下見(jiàn)消化液中有較多單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞小團(tuán)塊時(shí)即終止消化。

5. 細(xì)胞篩的運(yùn)用也是獲得高質(zhì)單個(gè)膀胱平滑肌細(xì)胞的基礎(chǔ)。

平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)方法可分為兩類(lèi)：組織塊法和酶消化法。組織塊法適用于細(xì)嫩、易碎的組織；其方法較簡(jiǎn)單；但容易產(chǎn)生雜質(zhì)如成纖維細(xì)胞等，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)快，故培養(yǎng)之細(xì)胞質(zhì)量較差；培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞無(wú)收縮性；且原代細(xì)胞的獲得需 3-4 周，獲得大量平滑肌細(xì)胞耗時(shí)長(zhǎng)^[1]。既往酶消化法較組織塊法復(fù)雜、精細(xì)；適宜的酶濃度和培養(yǎng)時(shí)間的確定較為困難；然而在較短時(shí)間內(nèi)可獲得大量的平滑肌細(xì)胞，1996 年Chambers等^[2]報(bào)道酶消化法純度為70%?？梢?jiàn)一種快速、、高純度的酶消化法培養(yǎng)膀胱平滑肌的方法顯得尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)研究?jī)芍煌盟袠?biāo)本均獲成功。倒置顯微鏡觀察平滑肌細(xì)胞24 小時(shí)均可見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，正常兔7 天左右、而梗阻兔則需10~12 天可于50ml 培養(yǎng)瓶約 80%匯合。

均傳代順利，傳代后約正常兔6 天左右、而梗阻兔需8~9 天可于50 ml 培養(yǎng)瓶約80%匯合。

本組中均傳至第8 代，經(jīng)第8 次傳代后，平滑肌細(xì)胞仍生長(zhǎng)迅速，未見(jiàn)衰老跡象。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷和峰”樣結(jié)構(gòu)。

細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型。

電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)。免疫組化染色檢測(cè)α-SMA呈陽(yáng)性反應(yīng)。

從細(xì)胞爬片HE染色和免疫組化染色檢測(cè)α-SMA呈陽(yáng)性反應(yīng)中我們發(fā)現(xiàn)該方法所的膀胱平滑肌細(xì)胞的純度幾乎 99%(在以下的膀胱平滑肌細(xì)胞的共聚焦檢測(cè)中也證實(shí)了這一點(diǎn))。

膀胱平滑肌的鑒定^[3]主要根據(jù)其細(xì)胞形態(tài)及α-actin的檢測(cè)。

倒置顯微鏡下觀察均呈“谷 和峰”樣結(jié)構(gòu)；細(xì)胞爬片HE染色見(jiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞細(xì)胞核呈兩端鈍圓的卵圓形平滑肌細(xì)胞核型；電鏡檢查可見(jiàn)平滑肌細(xì)胞密班結(jié)構(gòu)，這些細(xì)胞形態(tài)學(xué)的檢測(cè)均證實(shí)其為膀胱平滑肌細(xì)胞。

免疫組化染色檢測(cè)α-SMA呈陽(yáng)性反應(yīng)更進(jìn)一步證實(shí)了該方法所獲得的細(xì)胞為膀胱平滑肌細(xì)胞。

梗阻后的膀胱平滑肌細(xì)胞在生長(zhǎng)擴(kuò)增中明顯較正常膀胱平滑肌細(xì)胞 時(shí)間長(zhǎng)，說(shuō)明了這種酶消化法對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞的影響不是太大，還是保留著體內(nèi)的基本特性。

在我們的激光掃描共聚焦顯微鏡的檢測(cè)中平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣離子熒光強(qiáng)度在M受體激動(dòng)劑的影響下發(fā)生明顯變化，這更進(jìn)一步證實(shí)了該方法分離培養(yǎng)出的膀胱平滑肌仍保持著收縮功能。

1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24.

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3. ChamLey   CJ,Campbell   GR,Ross   R.The   smooth   muscle   cells   in   culture. Physiol   Rev,1979,599(1):1-61.

4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca²⁺ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478.

5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632.