關(guān)鍵字：Tn5、ATAC-Seq、LIANTI、單細胞

高通量測序（NGS）技術(shù)的發(fā)展以及實驗通量的不斷增加，要求NGS上游樣本處理步驟盡可能簡便，以提高NGS整個流程的工作效率。轉(zhuǎn)座系統(tǒng)具有快速“剪切、粘貼”、“復制、粘貼”的功能，已被創(chuàng)新應(yīng)用于NGS領(lǐng)域，如ATAC-Seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing，利用高通量測序檢測轉(zhuǎn)座酶易接近的染色質(zhì)），LIANTI（Linear Amplification via Transposon Insertion，通過轉(zhuǎn)座子的線性放大），單倍體分型，結(jié)構(gòu)變異檢測等，不僅簡便，有效縮短NGS樣本建庫時間，實現(xiàn)規(guī)模化快速測序，提高測序分辨率，同時能夠被靈活改造，應(yīng)用于更多的技術(shù)創(chuàng)新。

圖  移花接木——剪切，粘貼

1. 轉(zhuǎn)座因子的發(fā)現(xiàn)

20世紀40年代，美國遺傳學家芭芭拉.麥克林托克（Barbara McClintock）在某些玉米籽粒中發(fā)現(xiàn)了玉米色素顯現(xiàn)著一些稀奇古怪的模式。她觀察到玉米籽粒顏色的遺傳很不穩(wěn)定，有時籽粒上還出現(xiàn)一些斑斑點點。通過耐心的記錄和仔細的分析，她發(fā)現(xiàn)使籽粒著色的色素基因是在某一特定代上“接上”或“拉斷”的。1951年，在冷泉港生物學專題討論會上，麥克林托克遞交了自己的學術(shù)論文，向科學界同行報告了她的新理論，提出遺傳基因可以轉(zhuǎn)移，能從染色體的一個位置跳到另一個位置，甚至從一條染色體跳到另一條染色體上。她把這種能自發(fā)轉(zhuǎn)移的遺傳基因稱為“轉(zhuǎn)座因子”，并于1983被授予諾貝爾醫(yī)學獎。

轉(zhuǎn)座因子的發(fā)現(xiàn)改變了人們對基因組序列穩(wěn)定性的認識。自此以后，人們已經(jīng)在生物界各個領(lǐng)域證實了轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的廣泛存在，并將轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)開發(fā)成為各種生物基因分析的有效工具之一，極大促進了遺傳學的發(fā)展。

圖  Barbara McClintock

轉(zhuǎn)座因子（轉(zhuǎn)座子）根據(jù)其功能是“復制-粘貼”還是“剪切-粘貼”分為I型轉(zhuǎn)座子和II型轉(zhuǎn)座子兩類。I型轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座中間體是RNA，II型轉(zhuǎn)座中間體是DNA。II型轉(zhuǎn)座子，尤其是來源于細菌的Tn5轉(zhuǎn)座子，是NGS領(lǐng)域zui常用的轉(zhuǎn)座子。

2. 轉(zhuǎn)座子Tn5的轉(zhuǎn)座事件

Tn5轉(zhuǎn)座子是一種細菌轉(zhuǎn)座子，zui早由E. coli中發(fā)現(xiàn)，是一段含有若干抗性基因和編碼轉(zhuǎn)座酶基因的DNA片段（a）。其中IS50R和IS50L的序列高度同源，只是IS50L的一個堿基存在突變。IS50具有19bp的倒置末端（外末端outside end，OE和內(nèi)末端inside end，IE），兩末端倒置有7個堿基不同。此倒置末端是轉(zhuǎn)座酶（Tnp）的作用位點。IS50L和IS50R均含有編碼轉(zhuǎn)座酶（TnP）以及轉(zhuǎn)座阻遏蛋白（lnh）的基因，但由于IS50L中的堿基突變，造成翻譯提前終止，所以僅有IS50R可以產(chǎn)生正常的有活性的TnP和lnh。

圖 Tn5轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)

轉(zhuǎn)座事件發(fā)生時，兩個轉(zhuǎn)座酶（Tnp）分子（綠色標注）結(jié)合到Tn5轉(zhuǎn)座子的OE末端（黃色標注），形成兩個Tnp-OE復合體，隨后兩個復合體通過Tnp的C末端相互作用進行聯(lián)會，形成一個Tn5轉(zhuǎn)座復合體，此時Tnp產(chǎn)生切割DNA的活性。隨后Tnp利用切割活性，經(jīng)過一系列化學反應(yīng)切除供體DNA，離開供體鏈。當結(jié)合到靶DNA上時，Tn5轉(zhuǎn)座復合體識別并攻擊靶序列（Target site），將轉(zhuǎn)座子插入到靶序列中，粘性末端通過DNA聚合酶、連接酶作用進行填補，兩端形成9bp正向重復序列。整個轉(zhuǎn)座過程完成了基因從原始DNA被剪切之后粘貼在另一受體DNA的過程，實現(xiàn)了基因的“跳躍”。

圖 Tn5轉(zhuǎn)理

3. 轉(zhuǎn)座子Tn5用于NGS文庫構(gòu)建

NGS文庫構(gòu)建即把DNA樣本片段化或篩分成長度的目標序列，再加上寡核苷酸接頭P5、P7（和條形碼Barcode），用于后續(xù)測序上機。傳統(tǒng)建庫方式需要經(jīng)過DNA片段化、末端修復、接頭連接、文庫擴增、多次純化分選等步驟，耗時較長，將Tn5用于測序文庫構(gòu)建時，可將DNA片段化、末端修復、接頭連接等多步反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?/span>1步反應(yīng)，極大縮短建庫時間，提高工作效率。

Tn5用于NGS建庫的體外轉(zhuǎn)座要素包含：轉(zhuǎn)座子的末端序列、靶DNA、轉(zhuǎn)座酶（Tnp）和Mg²⁺（激活劑），轉(zhuǎn)座法建庫形成的文庫結(jié)構(gòu)如下：

圖 轉(zhuǎn)座法建庫文庫結(jié)構(gòu)

將P5、P7端部分接頭序列（Adapter 1/2）+轉(zhuǎn)座子末端序列設(shè)計合成供體DNA，Tnp識別轉(zhuǎn)座子末端形成帶有P5、P7端部分接頭的Tn5轉(zhuǎn)座復合體（見下圖）。該復合體識別受體DNA的靶序列（Target site），切斷受體DNA，并插入攜帶的供體DNA，形成一端帶有P5部分接頭Adapter 1，一端帶有P7部分接頭Adapter 2的DNA，之后通過PCR加上Barcode以及接頭其余部分，形成含P5端與P7端完整接頭的DNA文庫。

圖 Tn5轉(zhuǎn)座系統(tǒng)用于文庫構(gòu)建

4. Tn5轉(zhuǎn)座的前沿應(yīng)用

1）ATAC-Seq

ATAC-seq，全稱為Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing，即利用高通量測序檢測轉(zhuǎn)座酶易接近的染色質(zhì)）的技術(shù)。真核生物的核DNA并不是裸露的，而是有蛋白質(zhì)即組蛋白與之相結(jié)合的。DNA一圈一圈得纏繞在組蛋白上，形成串珠式的結(jié)構(gòu)。而這樣的結(jié)構(gòu)還能夠進一步折疊、濃聚，并在其他架構(gòu)蛋白的輔助下，形成染色體。當需要進行DNA的復制或者轉(zhuǎn)錄時，DNA的折疊結(jié)構(gòu)會被打開形成可接近區(qū)域，此時，ATAC-seq技術(shù)使用Tn5轉(zhuǎn)座酶進入并切割下暴露的DNA并同時連接上特異性的Adapters，連接上Adaptors的DNA片段被分離出來用于二代測序，從而獲得大量的細胞系和組織樣本基因表達、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄修飾等的信息。相對其他如MNase-seq，FAIRE-seq和DNase-seq等染色質(zhì)研究方法來說，ATAC-seq具有快速、樣本需求量少、一次性獲得全基因組上的染色質(zhì)開放區(qū)域等優(yōu)勢，在表觀遺傳學具有廣闊的發(fā)展前景。

圖 ATAC-seq原理

延伸閱讀：

[1] Buenrostro JD, Giresi PG, Zaba LC, Chang HY, Greenleaf WJ. Transposition of native chromatin for multimodal regulatory analysis and personal epigenomics. Nature methods. 2013;10(12):1213-1218. doi:10.1038/nmeth.2688.

[2] Buenrostro, JD., Wu, B., Chang, H. Y.&Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr. Protoc. Mol. Biol. 109, 21.29.1-9 (2015).

[3] Combining ATAC-seq with nuclei sorting for discovery of cis-regulatory regions in plant genomes. Nucleic Acids Research, 2017.

2）LIANTI

LIANTI，全稱為Linear Amplification via Transposon Insertion，即通過轉(zhuǎn)座子的線性放大，是一項經(jīng)過改良的單細胞全基因組擴增（whole-genome amplification，WGA）方法。 LIANTI法首先利用Tn5轉(zhuǎn)座子結(jié)合LIANTI序列，形成Tn5轉(zhuǎn)座復合體（含T7啟動子），之后該復合體隨機插入單細胞基因組DNA，經(jīng)轉(zhuǎn)座后，將DNA隨機片段化并連接T7啟動子。隨后T7啟動子行使體外轉(zhuǎn)錄功能，用轉(zhuǎn)錄獲得大量線性擴增的轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本再經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄之后得到大量的擴增產(chǎn)物，隨后進行正常的建庫測序操作。整個過程僅進行線性擴增，沒有進行指數(shù)擴增，大大增強了擴增穩(wěn)定性，降低PCR干擾，此外，該技術(shù)將該放法將測量拷貝數(shù)的空間分辨率提高了3個數(shù)量級（能在千堿基分辨率進行微CNV檢測，基因組覆蓋率可達到97%），助力更有效、更地檢測出更多遺傳疾病。

圖 LIANTI原理

延伸閱讀：

[1] Chen, C., Xing, D., Tan, L., Li, H., Zhou, G., Huang, L., & Xie, X. S. (2017). Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI). Science, 356(6334), 189-194.

5. 結(jié)語

轉(zhuǎn)座參與的普通建庫技術(shù)，有效縮短了建庫時間，滿足了測序市場對大規(guī)模樣本處理速度的需求，而轉(zhuǎn)座參與的特定研究方向建庫技術(shù)，如ATAC-Seq、LIANTI、CPT-seq等，則更多的滿足了科研人員們對于科學研究的需求。目前轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶的技術(shù)應(yīng)用在NGS領(lǐng)域還只是冰山一角，相信未來轉(zhuǎn)座酶/轉(zhuǎn)座子的可改造性會為NGS提供了更多的可能。

6. 參考文獻

Single-cell whole-genome analyses by Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI).

ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.

Transposons Tn10 and Tn5.

Structure/function insights into Tn5 transposition.

Transposons: DNA.

7. 產(chǎn)品推薦