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背景描述

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏（Amanita phalloides）的環(huán)狀七肽毒素，以高親和力（Kd= 20 nM）選擇性結(jié)合于絲狀肌動蛋白F-actin，而不會與單體肌動蛋白G-actin結(jié)合，通常用來標(biāo)記組織切片，細(xì)胞培養(yǎng)物或無細(xì)胞體系中的F-actin，從而對F-actin進(jìn)行定性和定量分析。另外，鬼筆環(huán)肽衍生物也以相近的親和力結(jié)合于大小纖維，無論是動植物來源的肌肉細(xì)胞或非肌肉細(xì)胞，按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環(huán)肽分子的計量比結(jié)合。且非特異性結(jié)合幾乎可忽略，染色區(qū)域和非染色區(qū)域辨識度非常明顯。因此，鬼筆環(huán)肽衍生物特別適合替代肌動蛋白（Actin）抗體進(jìn)行相關(guān)研究。另外鬼筆環(huán)肽衍生物很小，直徑約12-15Å，分子量＜2000 Daltons，未標(biāo)記肌動蛋白（Actin）的許多生理特性都得以維持，比如，同肌動蛋白結(jié)合蛋白如肌球蛋白，原肌球蛋白，DNase I等仍能發(fā)生反應(yīng)；鬼筆環(huán)肽標(biāo)記的纖維絲仍可穿透固相肌球蛋白基質(zhì)；以及甘油抽提的肌纖維標(biāo)記后仍可收縮等。

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態(tài)平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1µg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽，染色反應(yīng)特異性強(qiáng)，對比性高，具有比Actin抗體更好的染色效果，適合用作F-actin的定性和定量檢測。另外，經(jīng)本品結(jié)合后的F-actin仍能維持actin自身具有的許多生物學(xué)特性。且本品的結(jié)合沒有物種差異性，適用性廣泛。

我司分別提供凍干粉形式（貨號：40735ES80）和儲存液形式（貨號：40735ES75，濃度為20µM）的FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽，用戶根據(jù)自身需求選擇。建議使用濃度為80~200nM。

產(chǎn)品性質(zhì)

運輸與保存方法

冰袋運輸。-20℃避光干燥保存， 1年有效。

注意事項

1）   鬼筆環(huán)肽具有毒性，需小心操作（對人的半數(shù)致死劑量LD₅₀約2mg/kg）。

2）   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

 需要自備材料

1）     （可選）甲醇

2）     1×PBS緩沖液, pH 7.4, 細(xì)胞培養(yǎng)級別（貨號：60145ES76）

3）     固定液4%多聚甲醛（溶于PBS緩沖液）（貨號：36314ES60）

4）     丙酮或透化液0.5% Triton X-100（溶于PBS緩沖液）

5）     Fluoromount-G^TM 水溶性封片劑（不含DAPI）（貨號：36307ES08），DAPI（貨號：40727ES10）

6）     （可選）DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑（含DAPI）（貨號：36307ES08）

7）     （可選）BSA，標(biāo)準(zhǔn)級別（貨號：36101ES25）

8）     載玻片和蓋玻片

9）     蓋玻片周圍密封液（如透明指甲油）

10）  組裝有FITC激發(fā)/發(fā)射濾片，以及DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。

操作步驟

1.        工作液準(zhǔn)備

1）     對于FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（貨號：40735ES75，300T）

本品以溶于甲醇的20µM儲存液形式提供，總量為300µl。按照100 nM的工作液濃度來換算，可制備總量為60 ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）     對于FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽（貨號：40735ES80，1mg）

本品以凍干粉形式提供，分子量為1177.3，總量為1mg?？上扔眉状蓟蛘?/span>DMSO充分溶解配制成20~100µM的儲存液。如，加入8.494ml甲醇到1mg鬼筆環(huán)肽即得到100µM等量的儲存液，根據(jù)單次使用量，進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實驗前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.       染色步驟

1）     細(xì)胞爬片生長24h，使其密度達(dá)到50%匯合度。

2）     吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3）     使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。

4）     室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

5）     室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6）     室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

7）     取200µl配制好的 FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個密封的容器內(nèi)。

8）     用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

9）     使用200µl DAPI溶液（濃度：100 nM）對細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30s。

10）  用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-G^TM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油*封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6個月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（貨號：36308ES11）合并步驟9）10），簡化步驟。

11）  熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=496/516nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。