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Hieff Clone^TM Multi One Step Cloning Kit

多片段一步法快速克隆試劑盒

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Clone^TM Multi One Step Cloning Kit是一款簡單、快速、的多片段DNA定向克隆產(chǎn)品，該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)。將載體在克隆位點(diǎn)進(jìn)行線性化，并在插入片段PCR引物5’端引入線性化克隆載體末端序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列 (15 bp～20 bp)。將這種兩端帶有載體末端序列的PCR產(chǎn)物和線性化克隆載體按一定比例混合，在重組酶Exnase的催化下，僅需反應(yīng)30 min即可進(jìn)行轉(zhuǎn)化，完成定向克隆。克隆陽性率可達(dá)95%以上?？寺≥d體酶切產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物和插入片段PCR產(chǎn)物可以不進(jìn)行DNA純化直接用于重組克隆，極大的簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。

試劑盒中包含有針對(duì)多片段重組反應(yīng)而優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液和重組酶Exnase MultiS。使用該試劑盒，可以一次實(shí)現(xiàn)多至5個(gè)片段的順序拼接克隆。Exnase MultiS還兼容常規(guī)酶切、PCR反應(yīng)體系。

該試劑盒可用于多片段拼接克隆、全基因合成和DNA定點(diǎn)突變。

產(chǎn)品組分

運(yùn)輸與保存方法

冰袋（wet ice）運(yùn)輸。產(chǎn)品-20 oC保存。

實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)流程概覽

1)         線性化克隆載體制備；

2)         插入片段擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)；

3)         插入片段PCR擴(kuò)增；

4)         進(jìn)行重組反應(yīng)；

5)         反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板；

6. 克隆鑒定。

圖一 實(shí)驗(yàn)流程概覽

1. 制備線性化克隆載體

選擇合適的克隆位點(diǎn)，并對(duì)克隆載體進(jìn)行線性化。推薦您盡量選擇無重復(fù)序列且GC含量均勻的區(qū)域進(jìn)行克隆。當(dāng)載體克隆位點(diǎn)上下游20 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%～60%范圍之內(nèi)時(shí)，重組效率將達(dá)到zui大。

線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切（單酶切或雙酶切）或反向PCR擴(kuò)增獲得。

A．酶切制備線性化克隆載體

雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景 (假陽性克隆) 低。推薦使用。

單酶切線性化：線性化程度較差。可適當(dāng)延長酶切時(shí)間以降低轉(zhuǎn)化背景。

注：1）Hieff Clone^TM MultiS重組反應(yīng)體系內(nèi)無DNA連接酶，不會(huì)發(fā)生載體自連反應(yīng)。因此，即使是以單酶切方式制備的線性化載體也無需進(jìn)行末端脫磷酸處理。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后出現(xiàn)的假陽性克隆 (無插入片段) 是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。如這種假陽性克隆比例較高，應(yīng)重新制備線性化克隆載體。

2） Hieff Clone^TM MultiS重組反應(yīng)體系兼容幾乎所有的酶切反應(yīng)體系?？寺≥d體酶切產(chǎn)物加熱失活內(nèi)切酶(參見內(nèi)切酶使用說明書，例如Hind III，65℃孵育20 min*失活)后可直接用于重組反應(yīng)。

B．反向PCR擴(kuò)增制備線性化克隆載體

推薦您使用高保真聚合酶進(jìn)行載體擴(kuò)增 (Hieff^TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60) 以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR擴(kuò)增模板應(yīng)盡量使用預(yù)線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對(duì)克隆陽性率的影響。

Hieff Clone^TM MultiS重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如擴(kuò)增模板為預(yù)線性化質(zhì)粒且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化直接用于重組反應(yīng)。

克隆載體酶切產(chǎn)物或PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物DNA 純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒，直接使用進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，重組效率、克隆陽性率都會(huì)有所降低。因此，在進(jìn)行較大片段(>5kb) 克隆時(shí)，我們推薦您使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)線性化克隆載體進(jìn)行膠回收純化，以提高DNA 純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體 (其電泳位置不同于線性化克隆載體)。不同方式制備的線性化克隆載體的使用方式可查閱表一。

表一：線性化克隆載體的使用方式

注：直接使用酶切產(chǎn)物或擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，使用體積不應(yīng)超過4μl（重組反應(yīng)總體積的1/5）

2. 制備PCR產(chǎn)物

2.1設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物

Hieff Clone^TM MultiS引物設(shè)計(jì)總的原則是：通過在引物5’端引入線性化克隆載體末端同源序列，使得插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物5’和3’zui末端分別帶有和線性化克隆載體兩末端對(duì)應(yīng)的*一致的序列 (15 bp～20 bp)。

首先設(shè)計(jì)*片段的正向擴(kuò)增引物和第三片段的反向擴(kuò)增引物(與載體相鄰的兩個(gè)插入片段)。

*片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

5’——上游載體末端同源序列+*片段基因特異性正向擴(kuò)增序列——3’

第三片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

3’——第三片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+下游載體末端同源序列——5’

基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；

上游/下游載體末端同源序列為線性化克隆載體zui末端序列（用于同源重組）。

以pUC18作為克隆載體、進(jìn)行三插入片段順序拼接克?。?/span>5’至3’按克隆順序依次為：*片段、第二片段、第三片段）為例，引物設(shè)計(jì)方案如圖二所示。

圖二：重組引物設(shè)計(jì)方案

注：如zui終引物長度超過40bp，我們推薦您在引物合成時(shí)選用PAGE純化，可提高克隆成功率。計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算。

其次設(shè)計(jì)*片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物。用于片段之間進(jìn)行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴(kuò)增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴(kuò)增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 (*片段)的反向擴(kuò)增引物中為例，引物具體設(shè)計(jì)方案如圖三所示：

*片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

3’——*片段基因特異性反向擴(kuò)增序列+第二片段5’端同源序列——5’

第二片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式：

5’——第二片段基因特異性正向擴(kuò)增序列——3’

基因特異性正/反向擴(kuò)增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴(kuò)增引物序列；第二片段5’端同源序列即用于*片段與第二片段進(jìn)行重組的添加序列。zui后設(shè)計(jì)第二片段的反向擴(kuò)增引物和第三片段的正反向擴(kuò)增引物。設(shè)計(jì)方式與*片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式一致。具體方案參見圖三。

圖三：*片段的反向擴(kuò)增引物和第二片段的正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)示意圖

注：如zui終引物長度超過40bp，我們推薦您在引物合成時(shí)選用PAGE純化，可提高克隆成功率。計(jì)算擴(kuò)增引物退火溫度時(shí)，只需計(jì)算基因特異性擴(kuò)增序列的Tm值，載體末端同源序列不應(yīng)參與計(jì)算。

2.2 插入片段PCR擴(kuò)增

插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 擴(kuò)增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A加尾 (重組過程中將被去除，在zui終載體中不會(huì)出現(xiàn))。我們推薦您使用高保真聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增(Hieff^TM Pfu DNA Polymerase， Cat No. 10113ES60)，以減少擴(kuò)增突變的引入。

PCR結(jié)束后，取少量產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳以檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone^TM MultiS重組反應(yīng)體系兼容常規(guī)PCR反應(yīng)體系。因此，如擴(kuò)增模板不是與克隆載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，擴(kuò)增產(chǎn)物可以無需純化直接用于重組反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA純度較低，直接使用進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，重組效率、克隆陽性率都會(huì)有所降低。因此，在進(jìn)行較大片段 (>5 kb) 克隆實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們推薦您使用高質(zhì)量的試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化以提高DNA純度。插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物的使用方式可查閱表二。

表二：擴(kuò)增產(chǎn)物推薦使用方式

注：直接使用擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行重組反應(yīng)時(shí)，使用體積不應(yīng)超過4μl（重組反應(yīng)總體積的1/5）

*當(dāng)線性化克隆載體為酶切制備時(shí)，插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)DpnI消化結(jié)束后應(yīng)置于85℃加熱20 min將DpnI 失活，以避免重組反應(yīng)時(shí)殘留DpnI 對(duì)克隆載體的降解。

3. 重組反應(yīng)

3.1 配制反應(yīng)體系

于冰水浴中配制如下反應(yīng)體系。如果不慎將液體粘在管壁，可通過短暫離心使其沉入管底。

Hieff Clone^TM MultiS重組反應(yīng)體系z(mì)ui適DNA使用量為每片段（包括線性化克隆載體）0.03 pmol。該摩爾數(shù)對(duì)應(yīng)的DNA質(zhì)量可由以下公式粗略計(jì)算獲得：

每片段zui適使用量 = [0.02×克隆載體堿基對(duì)數(shù)]ng (0.03 pmol)

例如，將長度為0.5kb、1kb、2 kb三插入片段克隆至長度為5 kb的克隆載體時(shí)，各片段zui適使用量應(yīng)為：

線性化克隆載體zui適使用量：0.02 × 5000 = 100 ng

0.5 kb插入片段zui適使用量應(yīng)為：0.02 × 500 = 10 ng

1 kb插入片段zui適使用量應(yīng)為：0.02 × 1000 = 20 ng

2 kb插入片段zui適使用量應(yīng)為：0.02 × 2000 = 40 ng

注：1）線性化克隆載體的使用量應(yīng)在50～200 ng之間。當(dāng)使用上述公式計(jì)算DNAzui適使用量超出這個(gè)范圍時(shí)，直接選擇zui低/zui高使用量即可。

2）插入片段DNA使用量應(yīng)大于10 ng。當(dāng)使用上述公式計(jì)算DNAzui適使用量低于這個(gè)值時(shí)，直接使用10 ng即可。

3）線性化克隆載體和插入片段擴(kuò)增產(chǎn)物不進(jìn)行DNA純化直接使用時(shí)，加入總體積應(yīng)不超過反應(yīng)體系體積的1/5，即4 μl。

4）試劑盒中提供pUC19 control vector, linearized (50 ng/μl)和Control insert Mix (0.5 kb, 10 ng/μl; 1 kb, 20 ng/μl; 2 kb, 40 ng/μl)各5 μl，需要時(shí)可進(jìn)行陽性對(duì)照反應(yīng)，每次反應(yīng)各加1 μl。