【Chemical Science】雙功能熒光分子檢測富集5醛基尿嘧啶

*，一卵雙生的雙胞胎也不可能長得一模一樣，那么為什么具有相同的遺傳物質(zhì)的雙胞胎（DNA序列）卻在實際的生長過程中并非長得全部一樣呢（基因的表達(dá)）？表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域在這個方面有深入的探討。

DNA作為遺傳物質(zhì)在自然界的影響下會發(fā)生堿基修飾、突變甚至是缺失。DNA的甲基化和去甲基化就是生命過程中非常重要的一個環(huán)節(jié)。在去甲基化的過程中胞嘧啶的修飾物會經(jīng)歷從正常胞嘧啶（C）到5hmC（5-羥甲基胞嘧）再到5fC（5-甲?；奏ぃM(jìn)一步再氧化為5caC（5-羧基胞嘧啶）的過程，而胸腺嘧啶也可以被TET酶氧化成5hmU。研究發(fā)現(xiàn)醛基修飾的尿嘧啶（5fU）可能在表觀遺傳學(xué)中也會起到一定的作用，例如在引入堿基錯配，改變DNA的結(jié)構(gòu)等。通過化學(xué)手段，對生命體的有著特殊修飾的堿基的選擇性識別和富集是極其有必要的。

研究背景

2014年德國慕尼黑大學(xué)Thomas Carell教授報道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶變成5羥甲基尿嘧啶（Nat. Chem. Biol. 2014, 10, 574），這一結(jié)果揭示了胸腺嘧啶（T）的氧化產(chǎn)物（5hmU、5fU、5caU）可能存在著一定的表觀學(xué)意義（T的氧化關(guān)系見圖1）。2015年劍橋大學(xué)Balasubramanian shanker篩選了一系列的生物素化的有機(jī)小分子用于5醛基尿嘧啶的富集（J.Am. Chem. Soc., 2015, 137, 9270），并于今年，將其用在針對真核生物的寄生蟲利什曼原蟲（eukaryote parasite Leishmania）的5羥甲基尿嘧啶的全基因組測序（Genome Biol，2017,18，23)）。

圖1 胸腺嘧啶（T）的氧化關(guān)系圖

傳統(tǒng)的5fU-DNA鏈的合成主要通過Pt催化-氧化鋨氧化-高碘酸鈉氧化，由于其使用的催化劑劇毒限購，對設(shè)備要求高，使得很長時間5fU-DNA合成沒有顯著的突破。2017年武漢大學(xué)報道了一個丙二醇保護(hù)的5fU固相合成DNA單體，并將其結(jié)合到了傳統(tǒng)的DNA固相合成中，實現(xiàn)了對這一技術(shù)的突破（Nano Res., 2017, DOI:10.1007/s12274-017-1445-2.）。（圖2）

圖 2

研究思路

近日，學(xué)術(shù)期刊《Chemical Science》（IF=9.144）發(fā)表了武漢大學(xué)在這個領(lǐng)域內(nèi)的成果。該研究團(tuán)隊設(shè)計合成一個生物素化的含有鄰苯二胺結(jié)構(gòu)的萘酰亞胺探針，并將其用于熒光檢測在Hela細(xì)胞中經(jīng)過伽馬射線誘發(fā)產(chǎn)生的5fU，以及實現(xiàn)對5fU的選擇性富集。其中小分子的作用機(jī)理是通過鄰苯二胺中的氨基富裕的電子發(fā)生PET效應(yīng)，猝滅了萘酰亞胺的熒光。當(dāng)探針分子高選擇性的與5fU發(fā)生共價作用以后，PET效應(yīng)消失，熒光重新恢復(fù)，并且這個探針偶聯(lián)有生物素，可以在后期應(yīng)用于生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin—System,BAS)，實現(xiàn)對5fU的選擇性富集。（圖3）

圖3 基于PET熒光淬滅效應(yīng)選擇性富集熒光檢測的生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子

部分簡寫詞語的含義

5fU：5醛基尿嘧啶

5hmU：5羥甲基尿嘧啶

5caU：5羧基尿嘧啶

TET：Ten-eleven translocation，是生物體內(nèi)存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和2價Fe離子依賴的雙加氧酶。

光致電子轉(zhuǎn)移(PET)：光致電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移從而導(dǎo)致熒光的淬滅過程。具體PET過程如下：在光激發(fā)下，具有電子給予能力的鍵合基團(tuán)能夠?qū)⑵涮幱趜ui高能級的電子轉(zhuǎn)入激發(fā)態(tài)下熒光基團(tuán)空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無法直接躍遷到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光，從而導(dǎo)致熒光的淬滅;當(dāng)鍵合基團(tuán)與底物結(jié)合后，降低了鍵合基團(tuán)的給電子能力，抑制了PET過程，熒光基團(tuán)中被光激發(fā)的電子可以直接躍遷回到原基態(tài)軌道，從而增強(qiáng)了的熒光基團(tuán)的熒光發(fā)射。因此在未結(jié)合底物前，傳感器分子表現(xiàn)為熒光淬滅，一旦鍵合基團(tuán)與底物相結(jié)合，熒光基團(tuán)就會發(fā)射熒光。

生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin—System,BAS)：生物素－親合素系統(tǒng)（Biotin-Avidin—System,BAS）是70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域。近年大量研究證實：生物素—親合素系統(tǒng)幾乎可與目前研究成功的各種標(biāo)記物結(jié)合。生物素與親和素之間高親合力的牢固結(jié)合以及多級放大效應(yīng)，使BAS免疫標(biāo)記和有關(guān)示蹤分析更加靈敏。它已成為目前廣泛用于微量抗原、抗體定性、定量檢測及定位觀察研究的新技術(shù)。

研究結(jié)果

1、生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子對含有5fU-DNA鏈的選擇性反應(yīng)

研究人員首先嘗試了含有5fU的人工合成的DNA鏈，通過液相色譜，DNA凝膠電泳，熒光儀器以及聚合酶中止反應(yīng)證明了探針分子對5醛基尿嘧啶反應(yīng)的高選擇性（見圖4）。

圖4 生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子選擇性與5fU反應(yīng)

2、對伽馬射線處理Hela細(xì)胞的成像

作者將Hela細(xì)胞分成了三組，分別是進(jìn)行伽馬射線照射，不加化合物；不進(jìn)行伽馬射線照射，加化合物；以及伽馬射線處理后進(jìn)行化合物孵育。結(jié)果表明，探針分子與經(jīng)過伽馬射線氧化損傷以后的Hela細(xì)胞孵育后可以看到明顯的熒光響應(yīng)。（見圖5）

圖5 生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子對Hela細(xì)胞熒光顯色作用

3、探針分子對5fU富集

研究人員選用了實時定量PCR技術(shù)來對富集出來的5fU進(jìn)行定量，并且使用了上海翊圣生物科技有限公司的Hieff qPCR SYBR® Green Master Mix (No Rox )（貨號：11201ES08）這一優(yōu)勢產(chǎn)品。使用時，僅需在擴(kuò)增體系中加入模板和引物即可進(jìn)行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，縮短操作時間，降低污染幾率。

該產(chǎn)品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化，實時調(diào)節(jié)DNA聚合酶活性。配方添加了可有效抑制非特異性PCR擴(kuò)增因子與促進(jìn)PCR反應(yīng)擴(kuò)增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)獲得良好的線性關(guān)系。線性關(guān)系見圖6。

圖6.新貴品牌Yeasen Hieff^TM qPCR SYBR® Green Master Mix qPCR線性定量的結(jié)果

文章小結(jié)

創(chuàng)建了一個生物素化的鄰苯二胺-萘酰亞胺探針分子，不僅可以在生理條件下的熒光標(biāo)記5fU，還能對其進(jìn)行選擇性的富集。這一策略可以應(yīng)用于伽馬射線處理以后的Hela細(xì)胞中，也具有用來研究整個基因組修飾堿基含量的潛能。設(shè)計針對5fU檢測的化合物的策略可能適用于其他含有鄰苯二胺猝滅的熒光基團(tuán)。

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目前兩款產(chǎn)品均在*期間

產(chǎn)品信息：

活動內(nèi)容：其中，UNICON^TM為升級版產(chǎn)品，特異性和靈敏度更高，更適合低濃度模板擴(kuò)增。

活動條款：

1.活動時間：2017.4.10-2017.6.30

2.本活動可與“整裝待發(fā) 翊起GO”活動疊加參與；

3.本活動zui終解釋權(quán)歸上海翊圣生物所有。