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撥開迷霧：熒光定量?jī)?nèi)參基因

我們?cè)谶M(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)于內(nèi)參基因的選擇往往會(huì)不假思索地選擇GAPDH和β-actin或18S rRNA之類的內(nèi)參基因。貌似除了這些，我們并沒(méi)有別的更好的選擇。即使你對(duì)這些基因產(chǎn)生了質(zhì)疑，無(wú)論是查閱參考文獻(xiàn)還是與師兄師姐討論過(guò)后，依舊還是義無(wú)反顧的選擇之前的選擇。久而久之，GAPDH和β-actin或18S rRNA三位在內(nèi)參基因界的江湖地位就已經(jīng)不可動(dòng)搖了。

大家都知道，內(nèi)參基因的作用就是去除不同樣本在RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及逆轉(zhuǎn)錄效率上可能存在的差別，從而獲得目的基因特異性表達(dá)的真正差異。所以，我們會(huì)選擇內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化。通常我們選擇內(nèi)參基因的標(biāo)準(zhǔn)是①高度或中度表達(dá)，排除太高或者太低；②表達(dá)水平不受任何外源性因素等影響；③不存在假基因。

今天我們來(lái)扒一扒上述三個(gè)內(nèi)參基因。

GAPDH

為什么GAPDH被選作內(nèi)參基因？

GAPDH是甘油醛-3-磷酸脫氫酶的縮寫，經(jīng)典的糖酵解反應(yīng)中的一個(gè)酶。該酶廣泛存在于眾多生物體中，并且在細(xì)胞中含量豐富，占總蛋白的10%-20%。GAPDH基因有高度保守的序列，在同種細(xì)胞或者組織中的蛋白表達(dá)量一般是恒定的。故長(zhǎng)期以來(lái)該基因被廣泛用作qPCR或Western blot中的內(nèi)參基因。

GAPDH不適合選作內(nèi)參的情況

GAPDH基因是糖酵解中的關(guān)鍵基因，正是因?yàn)槿绱?，在代謝中過(guò)程中的表達(dá)很容易受到多種因素的影響。如在細(xì)胞的增殖過(guò)程中，細(xì)胞需要的能量ATP增多，糖酵解代謝加大，GAPDH基因的表達(dá)水平很有可能被上調(diào)。有報(bào)道稱，該基因可作為腫瘤發(fā)生的標(biāo)志物，在腫瘤組織與正常細(xì)胞及癌旁正常組織比較時(shí)，GAPDH表達(dá)并不一致。故在比較腫瘤組織與正常組織或細(xì)胞的某種基因或蛋白的表達(dá)時(shí)，GAPDH作為內(nèi)參應(yīng)慎重。

GAPDH基因功能的多樣性

β-actin

為什么β-actin被選作內(nèi)參基因？

β-actin選作內(nèi)參基因因其序列高度保守，其mRNA表達(dá)數(shù)量高，是橫紋肌肌纖維中的一種主要的蛋白成分，也是肌肉細(xì)絲及細(xì)胞骨架微絲的主要成分。該基因幾乎在所有真核細(xì)胞中表達(dá)，廣泛存在哺乳動(dòng)物動(dòng)物的組織與細(xì)胞內(nèi)。故其作為內(nèi)參基因是得到*的。

β-actin不適合選作內(nèi)參的情況

對(duì)于actin蛋白由幾種異構(gòu)體組成，actin大致可以分為6種，存在于組織分布特異性，不同actin之間具有較大的序列相似性(>90%)。在肌肉組織中β-actin分布很少，心肌中主要是alpha-cardiac muscle actin蛋白。故并不是所有的組織都適合選β-actin作為內(nèi)參。例如當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，β-actin mRNA的表達(dá)水平增加；而假基因的的存在也可干擾β-actin的檢測(cè)，此時(shí)并不適合選擇β-actin作為內(nèi)參。

18S rRNA

18S rRNA與30多種核糖體蛋白共同構(gòu)成真核生物核糖體40S小亞基，從而與60S大亞基一起完成細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成。

為什么18S rRNA被選作內(nèi)參基因？

18S rRNA作為內(nèi)參的原因可總結(jié)如下：①18S rRNA存在于核糖體小亞基中，其編碼基因rDNA（18S rRNA/rDNA）在生物演化過(guò)程中相當(dāng)保守；②存在于所有真核生物細(xì)胞中； ③易于使用通用引物擴(kuò)增；④rRNA的合成是由RNA聚合酶I合成，mRNA是由RNA聚合酶II合成，因此rRNA合成的調(diào)節(jié)獨(dú)立于mRNA，在影響mRNA表達(dá)的各種條件下，各種rRNA水平很少發(fā)生變化；⑤rRNA屬于高峰度表達(dá)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目標(biāo)mRNA，較其他內(nèi)參基因穩(wěn)定且受RNA降解影響較小。故18S rRNA被廣泛選作內(nèi)參。

同樣是rRNA的5S rRNA和5.8S rRNA以及28S rRNA就不適合作為內(nèi)參，因?yàn)?/span>①5S與5.8S在核糖體大亞基中的rRNA分子序列短，提供的信息少；②28S rRNA序列雖然較長(zhǎng)，可提供更多的信息，能更準(zhǔn)確地揭示系統(tǒng)發(fā)育的規(guī)律，但基因數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)信息較少，不利于比較分析。

18S rRNA不適合選作內(nèi)參的情況

然而，rRNA的轉(zhuǎn)錄易受到各種生物因素和藥物的影響。在有絲分裂期間，28S、18S rRNA明顯減少或停止表達(dá)。此外存在很大爭(zhēng)議的是rRNA不包括poly(A)尾，在以oligo(dT)為引物的cDNA合成中不能被逆轉(zhuǎn)錄，建議在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中除用oligo(dT)引物外，還要用18S作為反向引物，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用RNA酶處理一下，再高溫滅活。

其他內(nèi)參基因的表達(dá)情況

其實(shí)不僅僅是GAPDH和β-actin或18S rRNA這三個(gè)基因在作為內(nèi)參基因的存在問(wèn)題，其他的很多內(nèi)參基因在不同組織中的表達(dá)水平也是存在較大差異的。如不同內(nèi)參基因在不同組織中表達(dá)波動(dòng)較大的HPRT基因△CT為10.3；同一內(nèi)參基因在不同的組織中，如心，腦，胎盤，肺，肝，骨骼肌，腎等組織中表達(dá)也不是恒定的。見下圖：

結(jié)論

沒(méi)有一種RNA的表達(dá)水平在所有條件下是恒定的，在各種因素的影響下，如細(xì)胞周期的不同階段，內(nèi)參基因的RNA表達(dá)水平是變化的。至今，不存在任何一種基因適用于所有類型的細(xì)胞或組織。故我們研究者應(yīng)該根據(jù)自己所研究的細(xì)胞和組織類型以及實(shí)驗(yàn)要求，做預(yù)實(shí)驗(yàn)。從多種內(nèi)參基因中篩選出適合自己實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。同時(shí)也可以選擇多內(nèi)參基因的研究方法，設(shè)置兩個(gè)或兩個(gè)以上內(nèi)參基因，取平均值，然后去校正自己的目的基因能夠得到更可靠的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)

1. Radoni? A, Thulke S, Mackay I M, et al. Guideline to reference gene selection for quantitative real-time PCR.[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications, 2004, 313(4):856.
2. Mazurek S, Grimm H, Boschek C B, et al. Pyruvate kinase type M2: a crossroad in the tumor metabolome.[J]. British Journal of Nutrition, 2002, 87 Suppl 1(S1):S23.
3. Nicot N, Hausman J F, Hoffmann L, et al. Reference gene selection for RT-qPCRnormalization in potato during biotic and abiotic stress[J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(421):2907-2914.

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