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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

細胞核蛋白、細胞漿蛋白在細胞研究和蛋白質(zhì)組學(xué)中具有重要意義，因此在體外研究中需要將其從細胞或組織中分離。本試劑盒提供了一種較為簡單方便，高效的蛋白抽提方法，其原理是：通過細胞漿蛋白抽提試劑A和B，在低滲透壓條件下，使細胞充分膨脹，然后破壞細胞膜，釋放出細胞漿蛋白，然后通過離心得到細胞核沉淀。zui后通過高鹽的細胞核蛋白抽提試劑C抽提得到細胞核蛋白。

本試劑盒1次可對2×10⁶個細胞和30-50mg組織樣品進行抽提，按照該使用量，20126ES50可抽提50個樣品，20126ES60可抽提100個樣品。

產(chǎn)品組分

運輸和保存方法

冰袋運輸。-20℃保存，1年有效。

注意事項

1）客戶需自備PMSF。

2）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

將試劑盒各組分溶解后立即放置在冰上，混勻。取適量的胞漿蛋白抽提試劑A（以下統(tǒng)稱：試劑A）和胞核蛋白抽提試劑（以下統(tǒng)稱：試劑C）備用，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。

1 細胞樣品蛋白的抽提

1）細胞處理

對于貼壁細胞：PBS清洗細胞1次，EDTA溶液消化細胞或用細胞刮子刮下細胞，并用移液器吹打下細胞。離心收集細胞，盡量吸盡上清，留下細胞沉淀備用。

【注】：盡量避免用胰酶消化細胞，以免胰酶降解抽提的目的蛋白。

對于懸浮細胞：離心收集細胞，PBS清洗細胞1次，收集細胞，盡量吸盡上清，留細胞沉淀備用。

2） 每20μl細胞沉淀加入200μl含PMSF的試劑A。

【注】：對于2×10⁶個Hela細胞，其細胞沉淀的體積大約為20μl或40mg。

3） zui高速劇烈渦旋5s，*懸浮分散細胞沉淀。

【注】：如果細胞沉淀沒有*懸浮并分散開，可以適當(dāng)延長旋渦震蕩的時間。

4） 冰浴10-15min。

5） 加入胞漿蛋白抽提試劑B（以下統(tǒng)稱：試劑B） 10μl。zui高速劇烈渦旋5s，冰浴1min。

6） zui高速劇渦旋5s，4℃12,000-16,000g離心5min。

7） 立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，上清即為抽提得到的細胞漿蛋白。可以立即使用，也可以凍存?zhèn)溆谩?/span>

【注】：此步千萬不要觸及沉淀，可以在沉淀上方保留極小體積的上清，以免吸到沉淀。

8） 對于沉淀，*吸盡殘余上清，加入50μl含PMSF的試劑C。

【注】：此步需*吸盡上清，否則會帶來細胞漿蛋白的污染。

9） zui高速劇烈渦旋15-30s，把沉淀*懸浮并分散開。然后放回冰浴中，每隔1-2min再高速劇烈渦旋15-30s，共30min。10）4℃ 12,000-16,000g離心10min。

11）立即吸取上清至一預(yù)冷的塑料管中，即為抽提得到的細胞核蛋白?？梢粤⒓词褂?，也可以-70℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

2 組織樣品的抽提

1） 將組織切成非常細小的碎片。根據(jù)后續(xù)使用量按照20:1的比例混合試劑A和B，并加入PMSF至zui終濃度為1mM，混勻即可配制成組織勻漿液。按照每60mg組織加入200μl組織勻漿液的比例混合組織和組織勻漿液，并在玻璃勻漿器內(nèi)充分勻漿。

【注】：勻漿需在冰浴或4℃進行。

2） 勻漿后將勻漿液轉(zhuǎn)移至塑料離心管內(nèi)，冰浴放置15min。

3） 4℃ 1,500g離心5min。把上清轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的塑料管中，上清含部分細胞漿蛋白。

【注】：吸上清時千萬不要觸及沉淀。

4） 對于上述收集得到的沉淀，已經(jīng)充分勻漿，但很多細胞仍沒有破碎。接下來請參照【細胞樣品蛋白抽提】的步驟2）開始操作，即把沉淀當(dāng)做已經(jīng)離心收集好的細胞沉淀操作，即可得到細胞漿蛋白和細胞核蛋白。抽提得到的細胞漿蛋白可以和步驟【組織樣品抽提】中步驟3）抽提得到的細胞漿蛋白合并備用。

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