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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,制藥 |
|---|
產品介紹
產品簡介
Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix是2×實時定量PCR擴增的預溶液，具有熒光強度高，靈敏度高和特異性強，擴增產量高等特點，顏色為藍色，具有加樣示蹤的作用。核心組分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增。同時配方添加了提升PCR反應擴增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴增的促進因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內獲得良好的線性關系。
產品信息
貨號 | 11185ES03/11185ES08/11185ES50/11185ES60 |
規(guī)格 | 1 mL/5×1 mL/50×1 mL/100×1 mL |
儲存條件
-25~-15℃避光保存，有效期18個月。
使用說明
推薦qPCR反應體系
組分 | 體積 （μL）*** | 體積 （μL）*** | 終濃度 |
Hieff UNICON® Advanced qPCR SYBR Master Mix | 25 | 10 | 1× |
Forward Primer (10 μM)* | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM)* | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
模板DNA/cDNA** | x | x | - |
無菌超純水 | Up to 50 | Up to 20 | - |
表1 qPCR反應體系
*通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
**如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10，最佳模板加入量以保證擴增得到的Ct值在20-30個循環(huán)為宜。
***推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性；上機前需充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
反應程序
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數 |
預變性 | 95℃ | 2 min | 1 |
變性 | 95℃ | 10 sec | 40 |
退火/延伸* | 60℃ | 30 sec** | |
熔解曲線階段* | 儀器默認設置 | 1 | |
表2 qPCR反應程序
*退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。
**熒光信號采集：請勿忘記打開熒光信號采集，按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：
20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec：Applied Biosystems 7300
32 sec：Applied Biosystems 7500
***熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。
適用機型
ABI：7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio1, 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;
Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon,Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0, Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler; Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR
引物設計指南
推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。
正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
引物堿基分布均勻，避免出現連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。
引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物 3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
注意事項
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
解凍后Master Mix可能出現絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11141ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
若需要電泳，為了獲得清晰的條帶，建議將qPCR產物稀釋20-30倍后進行電泳。
本產品僅作科研用途！
