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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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10187ESPlant Tissue PCR Kit (With Dye)
| 參考價 | ￥50 |
具體成交價以合同協(xié)議為準(zhǔn)
- 10187ES 型號
- Yeasen/翌圣生物 品牌
- 生產(chǎn)商 廠商性質(zhì)
- 上海市 所在地
規(guī)格
| 5T | 50元 | 99 件 可售 |
訪問次數(shù)：222更新時間：2023-11-27 13:00:10
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- 網(wǎng)址：
- www.yeasen.com
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產(chǎn)品簡介
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè),制藥 |
|---|
產(chǎn)品介紹
產(chǎn)品簡介
Plant Tissue Direct PCR Kit (With Dye)植物組織直接PCR試劑盒是一款可直接對不同類型植物葉片進(jìn)行PCR擴(kuò)增的試劑盒，適應(yīng)性廣、穩(wěn)定性強(qiáng)。試劑盒采用的裂解緩沖液體系，可以快速的裂解多種植物樣品并釋放出基因組DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代謝產(chǎn)物等，即可將釋放出的基因組DNA作為模板直接用于PCR反應(yīng)。此外，樣品使用量少，低至1 mm植物葉片即可進(jìn)行實驗。
本試劑盒中提供的2× Plant Master Mix具有很強(qiáng)的擴(kuò)增兼容性，能直接以待測樣品裂解液為模板，進(jìn)行高效特異性擴(kuò)增。該試劑為2倍濃縮PCR反應(yīng)混合液，包含了用于PCR擴(kuò)增除模板和引物外的所有組分，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
該試劑盒可用于轉(zhuǎn)基因植株鑒定、植物基因分型等。
組分信息
類別 | 組分編號 | 組分名稱 | 10187ES05 | 10187ES50 | 10187ES70 |
Part I | 10187-A | Buffer P1 | 250 μL | 1.25 mL × 2 | 5 mL × 2 |
10187-B | Buffer P2 | 50 μL | 500 μL | 1 mL × 2 | |
Part II | 10187-C | 2 × Plant Master Mix* | 50 μL | 500 μL | 1 mL × 2 |
*2× Plant Master Mix：包含熱啟動Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反應(yīng)緩沖液、PCR反應(yīng)增強(qiáng)劑、優(yōu)化劑以及穩(wěn)定劑等，同時包含電泳Loading Buffer，PCR完成之后可直接電泳。
儲存條件
1. 試劑10187-A【Buffer P1】，置于2-8℃保存。有效期1年。
2. 試劑10187-B【Buffer P2】，中和裂解產(chǎn)物，利于更長時間保存樣本，置于2-8℃保存。有效期1年。
3. 試劑10187-C【2 × Plant Master Mix】，-25~-15℃保存，避免反復(fù)凍融。有效期1年。
使用說明
植物葉片
1、研磨裂解法：
a. 研磨儀破碎：將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，用研磨儀加鋼珠（鋼珠直徑3mm左右，共2個）破碎葉片（45 Hz，1 min），葉片破碎后溶液呈現(xiàn)綠色，瞬時離心，上清液請放在4℃?zhèn)溆茫? μL用于PCR擴(kuò)增。
b. 槍頭搗碎：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，用槍頭將葉片搗碎，搗碎后溶液呈現(xiàn)綠色，瞬時離心，上清液請放在4℃?zhèn)溆?，? μL用于PCR擴(kuò)增。
1、加熱裂解法：推薦使用幼嫩葉片。將直徑5 mm左右的葉片置于50 μL Buffer P1中，95℃加熱5-10 min（確保裂解液 浸沒葉片），較難裂解的葉片（老葉片）可適當(dāng)延長時間（10-20 min），加熱裂解后溶液呈現(xiàn)綠色，震蕩混勻，瞬時離心，上清液請放在4℃?zhèn)溆?，? μL用于PCR擴(kuò)增。
1、直接法：推薦使用幼嫩葉片。使用打孔器或者刀，將直徑1 mm左右的葉片直接加入到PCR反應(yīng)體系中；復(fù)雜樣本或者是長片段的擴(kuò)增，推薦使用直徑<1 mm的葉片。
PCR反應(yīng)體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
2× Plant Master Mix | 10 | 25 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 0.5 | 1 | 0.2-0.25 μM |
裂解產(chǎn)物（DNA模板） | 1 | 2 | - |
ddH2O | To 20 | To 50 | - |
表1 反應(yīng)體系
【注】：各組分使用前應(yīng)充分混勻。
模板加入量：小于PCR反應(yīng)體系的5%，過多會嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)，強(qiáng)烈推薦加入1 μL模板。葉片直擴(kuò)優(yōu)先推薦研磨儀裂解法。
引物終濃度：0.2-0.25 μM可以得到較好結(jié)果。反應(yīng)性能較差時，可在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)調(diào)整引物濃度。
反應(yīng)體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴(kuò)增的有效性和重復(fù)性。
體系配制：配制好PCR反應(yīng)體系，置于渦旋儀上渦旋混勻，瞬時離心將反應(yīng)液集于管底。
對照反應(yīng)：建議進(jìn)行PCR時，設(shè)置陽性和陰性PCR對照反應(yīng)以便于排除假陽性或假陰性的干擾。
為了更穩(wěn)定的保存裂解后的模板，將轉(zhuǎn)移出來的上清液，按照裂解產(chǎn)物（DNA模板）：Buffer P2 = 5:1的比例混合，混勻后-20℃保存，穩(wěn)定保存隨時間和樣本狀態(tài)不同而有所不同。如果處理后的植物葉片上清液一周內(nèi)用于PCR擴(kuò)增，不用加Buffer P2，上清液請保存在-20℃。
反應(yīng)條件
循環(huán)步驟 | 溫度 (°C) | 時間 | 循環(huán)數(shù) |
預(yù)變性 | 94 | 5 min | 1 |
變性 | 94 | 10 sec | 35 |
退火 | 50-65 | 20 sec | |
延伸 | 72 | 1 min/kb | |
終延伸 | 72 | 5 min | 1 |
表2 反應(yīng)條件 | |||
【注】：
退火溫度：請參考引物的理論 Tm 值，退火溫度可設(shè)置低于引物理論值 2-5℃。
延伸時間：需要根據(jù)片段的長度來確定，對于1 kb以內(nèi)的DNA片段，建議延長時間為1 min。
注意事項
做葉片實驗時，建議使用新鮮采取的葉片組織，若為長期冷凍組織，需-80℃保存，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融，以免造成模板降解，影響PCR效率。葉片組織以幼嫩為宜，若為成熟的葉片，避免使用葉片主脈部位組織。
建議擴(kuò)增片段長度1 kb以內(nèi)，以便擴(kuò)增效率佳。
取樣時使用打孔器或者刀取適宜大小的樣本，樣本不同時，打孔器或者刀每次處理樣本前需清洗干凈。
對于葉片組織，建議取1-10 mm的葉片，過小會使PCR擴(kuò)增產(chǎn)量低，過多會抑制PCR反應(yīng)，采用加熱裂解法、槍頭搗碎、研磨儀破碎的方式處理植物葉片，處理后需震蕩離心，務(wù)必取上清液試驗，沉淀會嚴(yán)重抑制PCR反應(yīng)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
本產(chǎn)品僅作科研用途！
常見問題與解決方法
常見問題 | 可能原因 | 解決方法 |
陽性對照、待測樣本均無條帶 | PCR反應(yīng)體系或反應(yīng)條件不合適。 | 使用梯度PCR摸索PCR最佳反應(yīng)條件。 |
PCR試劑保存不當(dāng)失去活性。 | 2× PCR Mix應(yīng)保存于-20℃，使用時避免反復(fù)凍融。若使用頻繁，可在4℃短時間存放。 | |
引物設(shè)計問題。 | 嘗試重新設(shè)計引物進(jìn)行檢查。 | |
陽性對照有目的條帶，待測樣本無條帶或條帶弱 | 裂解液、中和液加入比例不當(dāng)，裂解混合液影響PCR體系的pH值。 | 正常條件下，中和后的裂解混合液的pH應(yīng)該在7-8左右（裂解產(chǎn)物和Buffer P2嚴(yán)格按照5:1的量進(jìn)行中和）。 |
樣本裂解混合液保存不當(dāng)或保存時間過久，DNA基因組已經(jīng)降解。 | 裂解混合液液可在4℃保存5天，盡量使用新制備的裂解液混合液進(jìn)行PCR。 | |
模板加入量不適合。 | 在反應(yīng)體系<5%范圍內(nèi)優(yōu)化模板加入量。 | |
PCR循環(huán)數(shù)不足。 | 適當(dāng)增加PCR的循環(huán)數(shù)，推薦35-40循環(huán)為佳。因模板復(fù)雜，一般PCR反應(yīng)要比用純化的DNA模板多5-10個循環(huán)為佳。 | |
非特異性擴(kuò)增 | PCR退火溫度太低，循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度太高。 | 增加PCR退火溫度，降低PCR循環(huán)數(shù)、引物濃度或模板濃度。 |
PCR引物錯配。 | 重新設(shè)計PCR引物。 | |
配制PCR反應(yīng)體系時溫度太高或配制完成后放置時間太久。 | PCR反應(yīng)體系的配制在低溫下進(jìn)行，配制完成后盡快進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。 | |
陰性對照出現(xiàn)目的條帶 | 操作工具或試劑污染。 | 實驗所有試劑或器材均應(yīng)高壓滅菌。操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。 |
樣本間交叉污染。 | 每個取樣器只對一個樣本使用；或取完一個樣本后，將取樣器刃口浸入2%的次氯酸鈉溶液中，反復(fù)涮洗，然后用干凈的紙巾擦干殘液。 |
