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產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規(guī)格 | 價格（元） | *（元） |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix Hieff UNICON 2×實時定量PCR擴增預混液 | 11184ES03 | 1 mL | 383.00 | 223.00 |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix Hieff UNICON 2×實時定量PCR擴增預混液 | 11184ES08 | 5×1 mL | 1653.00 | 663.00 |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix Hieff UNICON 2×實時定量PCR擴增預混液 | 11184ES50 | 10×5 mL | 12533.00 | 6613.00 |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix Hieff UNICON 2×實時定量PCR擴增預混液 | 11184ES60 | 20×5 mL | 19833.00 | 12563.00 |
產品描述
Hieff UNICON 2×實時定量PCR擴增預混液是2×實時定量PCR擴增的預溶液，具有高靈敏度和高特異性的特點，顏色為藍色，具有加樣示蹤的作用。核心組分Hieff UNICON® Taq DNA聚合酶采用抗體法熱啟動，可以有效抑制樣品準備過程中引物退火導致的非特異性擴增。同時配方添加了提升PCR反應擴增效率因子和均衡不同GC含量（30~70%）基因擴增的促進因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區(qū)域內獲得良好的線性關系。
本產品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye，適用于所有qPCR儀器，無需在不同的儀器上調整ROX的濃度，只需在配制反應體系時加入引物和模板即可進行擴增。
運輸和保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。
本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
注意事項
1. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11141ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
2. 解凍后Master Mix可能出現絮狀或白色沉淀，手握緩慢溶解并上下輕柔顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4. 本產品僅作科研用途!
反應體系
組分 | 體積（μL） | 體積（μL） | 終濃度 |
Hieff UNICON® Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 25 | 10 | 1× |
Forward Primer (10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
Reverse Primer (10 μM) | 1 | 0.4 | 0.2 μM |
模板DNA | X | X | - |
無菌超純水 | to 50 | to 20 | - |
【注】：使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2 μM，也可以根據情況在0.1-1.0 μM之間進行調整。
b) 模板濃度：如模板為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的Ct值在20-30個循環(huán)為好。
d) 反應體系：推薦使用20 μL或50 μL，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
標準程序
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數 |
預變性 | 95℃ | 2 min | 1 |
變性 | 95℃ | 10 sec | 40 |
退火/延伸 | 60℃ | 30 sec★ | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設置 | 1 | |
快速程序
循環(huán)步驟 | 溫度 | 時間 | 循環(huán)數 |
預變性 | 95℃ | 30 sec | 1 |
變性 | 95℃ | 3 sec | 40 |
退火/延伸 | 60℃ | 20 sec★ | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設置 | 1 | |
【注】 快速程序適用于絕大多數基因，個別復雜二級結構基因可嘗試標準程序。
a) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。
b) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：
20 sec：Applied Biosystems 7700, 7900HT, 7500 Fast
31 sec：Applied Biosystems 7300
32 sec：Applied Biosystems 7500
c) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。
結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請?zhí)岣咄嘶饻囟?，或者重新設計更高特異性的引物。
引物設計指南
1. 推薦引物長度25 bp左右。擴增產物長度150 bp為佳，可以在100 bp-300 bp內選擇。
2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
3. 引物堿基分布要均勻，避免出現連續(xù)的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4. 引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。
5. 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6. 設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
適用機型
ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus; 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;
Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P;
Bio-Rad: CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex, realplex 2 s;
Qiagen: Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;
Roche Applied Science: LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96;
Thermo Scientific: PikoReal Cycler;
Cepheid: SmartCycler; Illumina: Eco qPCR.
相關產品
產品名稱 | 貨號 | 規(guī)格 | *（元） |
Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(gDNA digester plus) HOT | 11141ES60 | 100T | 1383.00 |
HB210701
翌圣生物科技（上海）股份有限公司 - 主營產品： 抗體,小分子抑制劑,熒光染料,干細胞培養(yǎng),血清
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