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供應(yīng)簡介

mMESSAGE mMACHINE® high yield capped RNA轉(zhuǎn)錄試劑盒是Ambion公司的技術(shù)，專門設(shè)計(jì)用于體外高產(chǎn)量合成帽狀RNA（即合成RNA的5端帶帽狀結(jié)構(gòu)），帽狀RNA模擬了大多數(shù)真核生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的mRNA結(jié)構(gòu)。試劑盒內(nèi)的帽狀類似物[m7G（5）ppp（5）G]與4種核苷酸混合在單一溶液內(nèi)，簡化了反應(yīng)步驟。

詳細(xì)介紹

原理：

帽狀類似物：GTP經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)為1:4，zui大化轉(zhuǎn)錄生成RNA和帽狀RNA所占比例。20ul的反應(yīng)體系加入1µg DNA模板在2h內(nèi)可以體外合成15-35 µg 7-甲基鳥苷帽狀RNA，其產(chǎn)量是傳統(tǒng)體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的10-50倍。

優(yōu)勢：

1）一步法直接合成帶帽狀結(jié)構(gòu)的RNA，其結(jié)構(gòu)與大多數(shù)真核生物體內(nèi)的mRNA結(jié)構(gòu)相同；

2）試劑盒內(nèi)酶混合液含RNase抑制劑，保護(hù)RNA不被降解；

3）試劑盒含對照模板（Xenopus elongation factor 1a, pTRI Xef），以檢測試劑盒的轉(zhuǎn)錄效率；

應(yīng)用：

帽狀RNA可直接用于下游實(shí)驗(yàn)：顯微注射入卵母細(xì)胞，體外翻譯，轉(zhuǎn)染或者其他。

試劑盒成分：（25 reactions）

1.75 ml， Nuclease-free Water。

50 μL Enzyme Mix （SP6, T7, or T3），50%甘油緩沖液含RNA聚合酶、Rnase抑制劑和其他。

50 μL，10X Reaction Buffer （SP6, T7, or T3），含鹽類、緩沖液、DTT和其他成分。

250μL，2X NTP/CAP （SP6, T7, or T3），一種中性緩沖液含有ATP/CTP/UTP/GTP/帽狀類似物。

100μL GTP，20 mM in SP6 Kits; 30 mM in T3 and T7 Kits。

100 μL，TURBO DNase （2 U/μL）。

10 μL，pTRI-Xef, 0.5 mg/mL （Control Template）。

1 ml，Ammonium Acetate Stop Solution。

1.4 mL，Lithium Chloride Precipitation Solution。

1.4 mL，Gel Loading Buffer II。

實(shí)驗(yàn)材料（自行準(zhǔn)備）：

DNA模板：待轉(zhuǎn)錄的DNA序列上游必須帶有正確的RNA聚合酶啟動位點(diǎn)（T7，T3或SP6）；

標(biāo)記核苷酸（選擇性）：[α-³²P] UTP or [α-³²P]CTP可加入反應(yīng)體系用作追蹤元素，方便定量檢測RNA合成量；

合成RNA純化試劑（選擇性）：緩沖液或飽和酚/氯仿，異丙醇，離心柱；

DNA模板（注意事項(xiàng)）：

（1）試劑盒選擇：根據(jù)帶轉(zhuǎn)錄的DNA序列上游帶有的RNA聚合酶啟動位點(diǎn)（T7，T3或SP6）選擇對應(yīng)的試劑盒；

（2）模板濃度：推薦使用0.5 μg/μL水溶液或TE溶液；

（3）模板大小：*長度是0.3-5.0kb，可用于更長或更短的模板，需適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)條件；

（4）模板方向：若合成sense RNA（正義RNA），使用RNA聚合酶對應(yīng)的細(xì)菌啟動子在5端或者蛋白質(zhì)編碼區(qū)的N末端；如果模板含有質(zhì)粒，經(jīng)多克隆位點(diǎn)內(nèi)切酶線性化后啟動子處于相反位置；若合成antisense RNA（反義RNA），使用RNA聚合酶對應(yīng)的細(xì)菌啟動子在3或者蛋白質(zhì)編碼區(qū)的C末端；

產(chǎn)品信息：現(xiàn)貨供應(yīng)！

貨號	名稱	產(chǎn)地	規(guī)格	報(bào)價(jià)	*/元	庫存
AM1340	mMESSAGE mMACHINE® SP6 Kit	Invitrogen	25T	6210	5279	是
AM1344	mMESSAGE mMACHINE® T7 Kit	Invitrogen	25T	6210	5279	3~4周
AM1348	mMESSAGE mMACHINE® T3 Kit	Invitrogen	25T	6210	5279	3~4周

參考文獻(xiàn)：

Aziz RB and Soreq H （1990） Improving poor in vitro transcription from GC-rich genes. Nucl. Acids Res. 18:3418.

Browning KS （1989） Transcription and translation of mRNA from polymerase chain reaction-generated DNA.Amplifications 3: 14–15.

Krieg PA and Melton DA （1987） In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. Meth. Enzymol. 155:397–415.

Krieg PA （1990） Improved Synthesis of Full-Length RNA Probes at Reduced Incubation Temperatures. Nucl. Acids Res. 18: 6463.

Milligan JF, Groebe DR, Witherell GW, and Uhlenbeck OC （1987） Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA template. Nucl. Acids Res. 15: 8783–8798.

Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition. （1989） editor C Nolan, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Mullis KB, and Faloona F （1987） Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase catalyzed chain reaction. Meth. Enzymol. 155: 335–350.

Schenborn ET and Mierindorf RC （1985） A novel transcription property of SP6 and T7 RNA polymerases: dependence on template structure. Nucl. Acids Res. 13: 6223–6236.

Stoflet ES, Koeberl DD, Sarkar G, and Sommer SS （1988） Genomic amplification with transcript sequencing. Science 239: 491–494.

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