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Anika Manzke是病毒清除產(chǎn)品經(jīng)理，Birte Kleindienst是病毒清除產(chǎn)品初級(jí)經(jīng)理，二人均供職于Sartorius Stedim Biotech

細(xì)菌、支原體和病毒等各種感染因子對(duì)生物反應(yīng)器的污染會(huì)對(duì)患者安全構(gòu)成潛在的威脅。近年來，病毒一直是導(dǎo)致多種生物反應(yīng)器污染的原因（1）。許多生物制藥公司已經(jīng)報(bào)告過鼠細(xì)小病毒（MVM）或皰疹病毒屬（2）等無包膜細(xì)小病毒對(duì)生產(chǎn)級(jí)生物反應(yīng)器造成的污染。制藥行業(yè)中的許多重量級(jí)公司都加入了CAACB來共同解決這一問題。

制造商可以采取多種方法降低細(xì)菌或支原體引起的細(xì)胞培養(yǎng)污染風(fēng)險(xiǎn)。但是，病毒（特別是無包膜細(xì)小病毒）引起的污染風(fēng)險(xiǎn)，即使是在使用化學(xué)限定培養(yǎng)基（1）的情況下，對(duì)生物制藥行業(yè)而言仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的除菌級(jí)過濾器,即使是0.1微米的過濾膜都不能防止無包膜微小病毒造成的污染。

病毒污染比細(xì)菌污染（3）更難以檢測(cè)。未能檢測(cè)到的病毒可能會(huì)污染整個(gè)下游過程，甚至是終藥品。許多公司因鼠細(xì)小病毒或皰疹病毒屬（2）污染而遭受了生產(chǎn)損失。針對(duì)所有上述情況，根源分析顯示，可能的源頭是在供應(yīng)鏈（4-6）早期儲(chǔ)存過程中的培養(yǎng)基組分（如鹽）污染。

圖1：病毒污染事件的逐漸升級(jí)關(guān)聯(lián)效應(yīng)

防止老鼠進(jìn)入這些倉庫的措施不夠充分。

這些污染事件可能對(duì)患者造成致命的后果。 

這些無包膜病毒的穩(wěn)定性高，因此它們可以長(zhǎng)期存活。即使是一個(gè)感染性顆粒也會(huì)污染整個(gè)生物反應(yīng)器。這一個(gè)顆粒會(huì)在生物反應(yīng)器中迅速復(fù)制。在它進(jìn)入生物反應(yīng)器之前，要在1000 L的培養(yǎng)基中找出這一個(gè)顆粒無異于大海撈針。

 污染影響

這種污染事件可能對(duì)患者造成致命的后果（參見圖1）。如果公司發(fā)現(xiàn)存在污染，不僅需要關(guān)閉工廠，還需要進(jìn)行大量的清潔工作。由此便可能導(dǎo)致藥物短缺，患者不能獲得救生藥物（7）。

上游病毒清除解決方案

上游工藝中需要有新的病毒清除理念。

過去，研究人員已經(jīng)研究了伽馬輻射、UV-C照射或高溫短時(shí)處理（HTST）等技術(shù)去除細(xì)胞培養(yǎng)基病毒的能力。如牛血清在伽馬照射下能清除大部分的病毒（8）。高溫短時(shí)處理需要大量投資，因此它僅在高流速下處理大量培養(yǎng)基時(shí)才是經(jīng)濟(jì)可行的（9）。然而，并非所有培養(yǎng)基組分都是熱穩(wěn)定的，而高溫短時(shí)處理系統(tǒng)線性放大也并非易事。UV-C受限于可應(yīng)用的流速，因此在制備大體積的培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)用有限。此外，從這些公開發(fā)布的方法數(shù)據(jù)來看，這些技術(shù)在滅活無包膜細(xì)小病毒方面的效果也良莠不齊。迄今為止，過濾這項(xiàng)有效的技術(shù)（對(duì)無包膜病毒特別有效）尚未被廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基過濾（10）。

下游病毒過濾器的瓶頸

為達(dá)到理想的病毒清除效果，一些公司已經(jīng)采用下游工藝中的除病毒過濾器來進(jìn)行培養(yǎng)基的過濾制備，以此盡量減少病毒污染的風(fēng)險(xiǎn)。因?yàn)樯a(chǎn)時(shí)間長(zhǎng)，流速低，所以公司可有效地將這些過濾器用于過濾灌注生物反應(yīng)器的培養(yǎng)基中的潛在病毒。采用傳統(tǒng)的下游工藝（DSP）過濾器過濾化學(xué)限定培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的過濾載量相當(dāng)高，能高達(dá)10.000 L/m²（11）。

如果可以在幾天內(nèi)而非數(shù)小時(shí)內(nèi)過濾這些培養(yǎng)基，傳統(tǒng)的DSP過濾器則是的解決方案，而且經(jīng)濟(jì)上可行，因?yàn)樾∵^濾面積已經(jīng)足以滿足需求。然而，在傳統(tǒng)的批量過濾中，情況并非如此。由于細(xì)菌污染的風(fēng)險(xiǎn)，培養(yǎng)基必須在至少24小時(shí)內(nèi)過濾，且理想情況下是在一個(gè)班次內(nèi)。為了提高過濾的整體速度，則需要更大的過濾面積，但這種方法成本昂貴，在經(jīng)濟(jì)上不可行。

經(jīng)濟(jì)上的可行方案

生物制藥行業(yè)需要解決將下游工藝除病毒過濾器用于上游培養(yǎng)基除病毒過濾的低流速和高成本問題，使其在經(jīng)濟(jì)上可行。這是開發(fā)專門用于培養(yǎng)基過濾（10）的代病毒截留過濾膜的背景。

方法

截留性能

每個(gè)5.0cm²的實(shí)驗(yàn)室用除病毒濾器都經(jīng)過了病毒挑戰(zhàn)實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)采用了作為“差條件”下的非脂包膜指示病毒-MVM 。它是細(xì)小病毒家族的12-26納米單鏈無包膜ssDNA病毒。實(shí)驗(yàn)使用5.0cm²的除病毒濾器，在2.0bar的恒定壓力下過濾3種不同的培養(yǎng)基，并進(jìn)行二次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。在1%的病毒加入量下，過濾了400 L/m²。

膜載量測(cè)試

膜過濾載量采用了三個(gè)不同供應(yīng)商的15種不同培養(yǎng)基來測(cè)定。所有測(cè)試均在2.0bar的恒壓下進(jìn)行。

表1：新型除病毒培養(yǎng)基濾器的截留能力，實(shí)驗(yàn)室用濾器（5 cm²）。

圖2：在4小時(shí)的過濾時(shí)間內(nèi)，15種細(xì)胞培養(yǎng)基（CCM）在恒壓2.0bar下的通過量一覽；培養(yǎng)基除病毒過濾器，實(shí)驗(yàn)室用。

4小時(shí)過濾后對(duì)總過濾量進(jìn)行了測(cè)量。

結(jié)果

截留性能

表1總結(jié)了使用新型膜進(jìn)行測(cè)試的截留數(shù)據(jù)。膜的病毒截留性能同下游工藝應(yīng)用中使用的過濾器相當(dāng)。無包膜細(xì)小病毒MVM的截留量超過4個(gè)對(duì)數(shù)值。分析方法檢測(cè)不到濾液中的MVM?？珊侠眍A(yù)期該膜會(huì)截留比細(xì)小病毒更大的潛在污染因子。

不同化學(xué)限定成分細(xì)胞培養(yǎng)基的膜通過量

膜的通過量采用了三個(gè)不同供應(yīng)商的15種培養(yǎng)基來測(cè)定。圖2表明了在2bar壓力下，4小時(shí)的培養(yǎng)基處理載量因培養(yǎng)基組分不同而差別很大。例如，Lonza Power CHO2相對(duì)較快地造成了膜堵塞，而Lonza ProPER1培養(yǎng)基似乎*不堵膜。

對(duì)于一些商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過濾器顯著提高了除病毒過濾膜載量（7）。但僅部分培養(yǎng)基可行，有些則沒起作用。諸如泊洛沙姆等保護(hù)劑大幅降低了過濾流速（10）。

對(duì)于一些商業(yè)化細(xì)胞培養(yǎng)基，使用串聯(lián)0.1微米過濾器顯著提高了膜通過量。

降低泊洛沙姆濃度或在添加至培養(yǎng)基以前過濾能大幅提高過濾器的過濾量。業(yè)界應(yīng)該展開更多研究，從而充分了解不同培養(yǎng)基組分對(duì)培養(yǎng)基過濾器過濾性能的影響。根據(jù)本研究，可設(shè)計(jì)出一種既能改善過濾性能又不影響后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)工藝的培養(yǎng)基。不過，研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)基通常的4小時(shí)過濾中，開發(fā)的新膜通常過濾載量約1000 L/m²。因此，對(duì)于批量制備培養(yǎng)基，這種新膜是經(jīng)濟(jì)上可行的辦法，同時(shí)也降低了細(xì)胞培養(yǎng)基的病毒污染風(fēng)險(xiǎn)。

結(jié)論

在本文中，作者介紹了一種新的病毒截留膜，上游工藝工程師可使用它來過濾化學(xué)限定培養(yǎng)基，從而降低風(fēng)險(xiǎn)。此外，作者已經(jīng)證明該方法可截留4個(gè)Log以上的非包膜細(xì)小病毒。當(dāng)過濾一系列不同型號(hào)的化學(xué)限定培養(yǎng)基時(shí)，該膜的通量較高，生物制藥公司能夠在上游工藝中使用這種膜，而且不會(huì)對(duì)工藝成本造成不利的影響。該膜有可能成為基于風(fēng)險(xiǎn)控制來zui大程度地降低病毒污染事件的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)提高生物制藥公司的生產(chǎn)能力。

REFERENCES

1.P. W. Barone, PhD, “Lessons Learned from the Consortium on Adventitious Agent Contamination in Bio Manufacturing,” Viral Safety for Biologics, Cologne, June 21, 2016.

2. Bethencourt, Nature Biotechnology 27, 681 (2009), www.nature。。ｃｏｍ/nbt/journal/v27/n8/full/nbt0809-681a

3.O.-W. Merten, Cytotechnology 39, 91–116 (January 9, 2003).

4.M. Moody, PhD, “MMV Contamination–A Case Study: Detection, Root Cause Determination, and Corrective Actions,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

5.Jim Skrine, “A Biotech Production Facility Contamination Case Study–Minute Mouse Virus,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

6.Linda Hendricks, “Case Study of Apparent Virus Contamination in Biopharmaceutical Product at Janssen,” PDA/FDA Adventitious Viruses in Biologics: Detection and Mitigation Strategies Workshop, Bethesda, Maryland, Dec. 1-2, 2010.

7.B. Kleindienst, “Proof of Concept–The first virus retentive membrane for risk mitigation in upstream,” Viral Safety & Raw Materials for Biologics, Cologne, June 22nd, 2016.

8.G. Gauvin and R. Nims, PDA Journal, Vol. 64, No 5, 432-435, 2010.

9.B. Hansmann, V. Thom, A. Manzke, “Contamination Risk Mitigation in Cell Culture Media Preparation,” Virus & TSE Safety Forum, Lisabon, June 9-11, 2015.

10.A. Meyer, “Risk Mitigation in Media Preparation—Current Possibilities and Future Trends,” PDA Virus & TSE Safety Forum, Berlin, June 5, 2013.

Thomas R. Kreil, “Virus Safety—A Look into the Entire Process Raw Materials, Upstream, Downstream,” European Upstream and Downstream Technology Forum Goettingen, September 8-10, 2014. ◆

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