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?無菌是細(xì)胞治療的一項關(guān)鍵質(zhì)量屬性。由于細(xì)胞治療產(chǎn)品的微生物污染可能會導(dǎo)致接受者危及生命的感染，無菌檢查是任何細(xì)胞治療產(chǎn)品的放行檢測中的關(guān)鍵組成部分。

目前的藥典無菌檢查需要14天才能確定排除污染，這對于有效期短的細(xì)胞療法藥品來說太長了，特別是那些用于治療晚期病人的自體細(xì)胞療法藥品。因此，市場對不依賴于微生物生長的快速檢測方法的需求與日俱增。

在本研究中，Microsart® ATMP細(xì)菌實時PCR檢測試劑盒的穩(wěn)健性通過在三種不同的檢出限，分別是2xLOD₉₅、LOD₉₅ 和½ LOD₉₅ 條件下用產(chǎn)孢梭菌（ATCC 19404）加入DMEM+5%FBS來證明，由5名參與者進(jìn)行檢測，他們是來自生物制藥行業(yè)和醫(yī)院附屬實驗室的代表。將樣本冷凍運(yùn)送給所有檢測參與者，以便在他們所在的檢測中心使用Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒和Microsart® ATMP細(xì)菌檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

借助于貝塔測試，本研究的結(jié)果證明，基于實時PCR檢測的細(xì)菌污染快速檢測是一種穩(wěn)健且適用的方法，可有助于降低風(fēng)險從而有益于患者安全。

材料和方法

每名貝塔測試參與者都收到了所需的試劑盒和耗材（參見表1）。

所需的實驗室儀器和設(shè)備由參與者提供，如實時PCR 儀等。參與者未知的加標(biāo)樣本（參見表2）由賽多利斯提供。

所有貝塔測試參與者都遵守了以下步驟：

1. 將1ml NEC 分別移液至2個處理管（處理管在Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒中）中，并標(biāo)記“NEC 1”和“NEC 2”。

2. 將950μl 基質(zhì)分別移液至管1至管8中（每管中已經(jīng)含有50μl 未知加標(biāo)樣本），然后用漩渦混勻器混合。

3. 根據(jù)Microsart® 細(xì)菌提取試劑盒檢測方案，提取所有10個樣本（2個NEC，8個未知）的DNA。

4. 根據(jù)Microsart® ATMP 細(xì)菌檢測試劑盒檢測方案，對PCR 進(jìn)行設(shè)置。

5. 重復(fù)分析DNA 提取物（DNA 提取和PCR 設(shè)置的樣本數(shù)量概述如表3所示）。

6. 對于數(shù)據(jù)分析，遵循使用了手冊中的說明。

結(jié)果

預(yù)期結(jié)果如表4所列。如果所有含有LOD₉₅ 和2x LOD₉₅ 濃度的產(chǎn)孢梭菌（ATCC 19404）的樣本均已檢測為陽性，每名參與者的8個NEC 中至少有6個為陰性，每名參與者的2個PCR 對照都必須為陰性，且每名參與者的2個PCR 陽性對照都為陽性，則滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)。

討論

根據(jù)參與者們的報告結(jié)果，5名參與者中有4名正確分析了所有未知樣本。關(guān)于一名參與者未檢測出最高濃度的樣本而可以檢測較低的濃度，可以認(rèn)為這是由于操作錯誤而不是由于Microsart® ATMP 細(xì)菌檢測試劑盒的靈敏度問題造成的。所有實驗室都將這些樣本正確地識別為陰性。

因此，每名參與者至少有6個陰性提取對照均為陰性，滿足可接受標(biāo)準(zhǔn)。1名參與者在一個PCR 無模板對照中檢測出一個陽性信號。我們的結(jié)論是：最有可能的原因是移液失誤，因為該參與者已經(jīng)按照預(yù)期檢出了所有其他樣本。

基于參與者都是未經(jīng)培訓(xùn)的用戶、僅由賽多利斯用戶說明指導(dǎo)、使用各種不同的PCR儀、且大多沒有專用的無DNA 實驗室條件，該結(jié)果依然證明了本次測定的實驗室間精密度和穩(wěn)健性。

總結(jié)