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由于細(xì)胞容易受到細(xì)胞處理的物理方式及用于培養(yǎng)物接種及填充的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備帶來的影響，因此在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中應(yīng)避免塑料實(shí)驗(yàn)室用具產(chǎn)生的浸出化合物。賽多利斯移液器多款吸頭釋放的浸出物含量極低，即使在苛刻的酸性或溶劑條件下也遠(yuǎn)低于能夠?qū)?xì)胞健康或生物測定產(chǎn)生影響的水平。

下載本篇《細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)室耗材在確保最佳細(xì)胞健康中的重要作用》應(yīng)用說明，了解賽多利斯移液器吸頭低浸出物含量對細(xì)胞培養(yǎng)過程的重要作用。

細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用在研發(fā)過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。然而，許多因素都會影響體外培養(yǎng)細(xì)胞的健康，其中包括從用于細(xì)胞接種、補(bǔ)料和處理的耗材中的浸出物。浸出物是指在標(biāo)準(zhǔn)使用和儲存條件下從塑料實(shí)驗(yàn)室耗材中釋放出的化合物和微量金屬。表1 中列出了的文獻(xiàn)闡述了不同塑料浸出物對細(xì)胞生長、形態(tài)和功能的具體影響。

考慮到這些風(fēng)險(xiǎn)，需要在細(xì)胞培養(yǎng)工作流程的每個(gè)步驟中盡可能減少可能存在的浸出物。為確保在細(xì)胞培養(yǎng)流程中細(xì)胞的健康，我們通過多種方法，測試了不同移液器吸頭的表現(xiàn)。

測試的方法如下

移液器吸頭的微量金屬浸出物分析

將二次蒸餾濃縮的HNO3（100μL）吸入至200μL 賽多利斯Optifit 吸頭、Safetyspace® 濾芯吸頭和及其低吸附吸頭型號中，保持5 秒鐘，然后分配到酸洗樣品管中。然后將排出的溶劑再次吸入至相同的移液器吸頭，并分配到相同的酸洗樣品管中。對每個(gè)移液器吸頭重復(fù)該浸出循環(huán)共十次。使用超純水將每個(gè)樣品管中的溶液稀釋至1N HNO3 濃度。使用ICP-MS，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣品。使用Nu AttoM SC-ICPMS對所有樣品進(jìn)行分析。使用1ppm的多元素亞組分溶液制備1000ppt、100ppt 和10ppt 標(biāo)準(zhǔn)品。在低分辨率模式下，在10個(gè)周期內(nèi)進(jìn)行500 次10ms 的掃描，在峰值跳躍模式下進(jìn)行分析。

移液器吸頭的浸出化合物分析

使用100μL 乙醇或二甲基亞砜清洗200μL Optifit 吸頭、Safetyspace® 濾芯吸頭及其低吸附型號，具體方法為將溶劑吸入移液器吸頭，保持5 秒鐘，然后直接分配到樣品管中。使用多個(gè)相同類型的移液器吸頭（五個(gè)移液器吸頭，共500μL，混合樣品）生成足以通過GC-MS 或LC-MS 進(jìn)行化學(xué)浸出物分析的測試體積。

GC-MS

通過液- 液萃取制備乙醇和水提取物，并進(jìn)樣至Clarus 600GC-Clarus 600T MS Turbo 和C18 Elite-5MS（60m×0.25mm×0.25μm）色譜柱。通過使用內(nèi)標(biāo)2- 氟聯(lián)苯（10μg/ml）進(jìn)行液體注射，使用甲苯 -d8（ 0.1μg/ml）進(jìn)行頂空注射，進(jìn)行半定量。

細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠 B16F10（ATCC® CRL6475™）細(xì)胞以不同密度接種在 96 孔板上，使用單道Picus® Nxt50-1000μL 移液器制備細(xì)胞系列稀釋液（1:2 稀釋）。使用 Picus® Nxt 5-120μL 和 10-100μLTacta® 移液器完成培養(yǎng)板接種（100μL/ 孔）。根據(jù)制造商的說明，在接種后 24 小時(shí)，采用基于甲瓚的分析測定細(xì)胞存活能力。在補(bǔ)充有 10% 胎牛血清和 100U/mL 青霉素鏈霉素Dulbecco 改良 Eagles 培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。

 

基于上述方法得出如下結(jié)果

1、移液器吸頭含有極少量的微量金屬

表3 列出了由吸頭制造商提供的一些微量金屬濃度和檢測限數(shù)據(jù)。根據(jù)表2 中的細(xì)胞毒性微量金屬水平來評估這些濃度和檢測限時(shí)，表3 中的某些值和檢測水平顯然超過了表2 中的細(xì)胞毒性值。在對比不同制造商的合格證書時(shí)，務(wù)必注意其中的檢測水平和檢測方法；微量金屬測試限值應(yīng)較低，并與金屬可能的細(xì)胞毒性水平保持一致。

表2：金屬的細(xì)胞毒性濃度示例

表3：賽多利斯和其他制造商移液器吸頭的微量金屬測試結(jié)果和檢測水平示例（μg/mL=ppm）

 

2、浸出化合物的含量低于干擾水平

使用 GC-MS 對低吸附吸頭中的對己二酸乙酯進(jìn)行定量，最大濃度為 0.25ppm。檢測到一種保留時(shí)間為 8.32 分鐘的未知化合物，其最大濃度為 0.13ppm，但由于結(jié)構(gòu)信息不充分，所以無法對其進(jìn)行表征。未檢測到超出其定量限的其他化合物（表 4）。

 

表4：賽多利斯移液器吸頭化學(xué)浸出物

*低于定量限 †低于檢測限

‡分析中沒有樣品的DiHEMDA 呈陽性，因此未確定 LOQ

3、賽多利斯低吸附移液器吸頭的安全性和耐用性

下圖顯示了一項(xiàng)研究結(jié)果，該研究比較了不同 LR 移液器吸頭在低吸附性能穩(wěn)定性方面的差異。用溶劑（異丙醇、丙酮或二甲基甲酰胺）清洗吸頭 20 次，然后用水清洗三次。完成清洗步驟之后，通過測定移液后吸頭中殘留液體的量來測試吸附情況。使用賽多利斯低吸附吸頭時(shí)，溶劑處理后的殘留液體量始終較低。即使是標(biāo)準(zhǔn)（非 LR）賽多利斯移液器吸頭，其表面吸附量也低于許多其他制造商生產(chǎn)的 LR 吸頭。

 

?圖1：低吸附涂層在溶劑處理后的穩(wěn)定性。詳細(xì)數(shù)據(jù)請參見賽多利斯低吸附吸頭應(yīng)用說明。

 

總結(jié)

 

賽多利斯吸頭在如下幾方面能夠有效優(yōu)化細(xì)胞健康：

• 吸頭釋放的金屬和化學(xué)物質(zhì)水平非常低，因此適用于細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用

• 已證明芥酸酰胺、油酰胺和bDtBPP 對生物測定和細(xì)胞生長有負(fù)面影響，而賽多利斯移液器吸頭釋放的這些物質(zhì)的水平可以忽略不計(jì)

• 低吸附吸頭即使在用溶劑處理后也能保持其低吸附性能

• 吸頭根據(jù)最高品質(zhì)和純度標(biāo)準(zhǔn)制造，因此無需添加潤滑劑（如油酰胺）等添加劑