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?誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC，簡稱為iPS細(xì)胞），是一種由哺乳動物成體細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)錄因子等手段脫分化形成的多能干細(xì)胞，最早由日本學(xué)者山中伸彌的研究團(tuán)隊于2006年發(fā)現(xiàn)。作為研究發(fā)育或疾病分子機(jī)制的理想研究工具，識別新治療靶點和高通量藥物篩選方面的廣闊應(yīng)用[1]。

雖然iPSC研究已經(jīng)取得長足進(jìn)步，但在后續(xù)的研究過程中，仍存在一些挑戰(zhàn)。誘導(dǎo)iPSC生成的過程中，效率低、致瘤性、外源基因插入等問題仍然存在，iPSC誘導(dǎo)向人體組織細(xì)胞的過程中也存在成熟度不足、致瘤性風(fēng)險等問題，需要培養(yǎng)方法的優(yōu)化以及對重編程分子機(jī)制的進(jìn)一步研究。要解決這一系列問題，必須通過高通量的研究發(fā)現(xiàn)新的靶點和培養(yǎng)及誘導(dǎo)方法，Incucyte® 實時活細(xì)胞分析系統(tǒng)和iQue® 高通量流式細(xì)胞儀可以滿足高通量研究的需求，為iPSC研究插上騰飛的翅膀。

Incucyte®                                                                                                      iQue®

Incucyte® 在iPSC研究中的應(yīng)用

工欲善其事，必先利其器。在iPSC的研究過程中，在不挪動細(xì)胞的前提下，Incucyte® 可以實現(xiàn)長時間實時監(jiān)測iPSC向特定細(xì)胞類型分化的整個分化過程中細(xì)胞特征的變化，包括細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡等指標(biāo)，并且一次可放6塊培養(yǎng)板，滿足高通量活細(xì)胞成像的要求。

iPSC研究大致有兩個方向：

1 優(yōu)化培養(yǎng)條件、誘導(dǎo)體系等以期獲得更穩(wěn)定的iPSC細(xì)胞系；iPSC細(xì)胞呈現(xiàn)克隆生長，為確定不同iPSC細(xì)胞系，哪種在后續(xù)基因編輯以及誘導(dǎo)中更加穩(wěn)定，對各個細(xì)胞系實時監(jiān)測，通過匯合度計算增殖情況^[7]。

圖1. 候選細(xì)胞系的增殖特征：

A：Incucyte® 記錄不同iPSC細(xì)胞系傳代三天后的圖片；B：3×104 個細(xì)胞接種48h細(xì)胞消化計數(shù)；C：使用Incucyte® 計算3個時間點匯合度（confluence）來評估iPSC增殖情況

2 模擬疾病模型以及分化出更成熟的成體組織細(xì)胞，包括優(yōu)化誘導(dǎo)條件以及改為3D培養(yǎng)等。下面兩篇文獻(xiàn)的Figure展示了向神經(jīng)以及心肌細(xì)胞方向的分化：

圖2. 體外培養(yǎng)20天的分化神經(jīng)熒光細(xì)胞簇：

在iPSC向神經(jīng)細(xì)胞分化的過程中，用βIII-tubulin (TUJ1) 對未成熟神經(jīng)元的聚集體進(jìn)行染色，并顯示從(a)陰性對照聚集體、(b)未加載的微球結(jié)合聚集體、(c)微球結(jié)合聚集體和(d)陽性對照聚集體[8]。Incucyte® 自動拍攝36張單獨圖像組合而成，用 ImageJ 軟件拼接和裁剪。比例尺：300 μm。

圖3. hiPSC-CM 實時凋亡信號檢測

心肌分化，作者利用一種新的Metabolic Selected的誘導(dǎo)選擇方法制備缺血性心肌病模型的心肌細(xì)胞，這種模型的心肌細(xì)胞應(yīng)具備Dox毒性敏感特征。利用我們的活細(xì)胞凋亡指示劑[9]實時檢測在加入Dox后心肌細(xì)胞的死亡情況發(fā)現(xiàn)Annexin V+的細(xì)胞比例隨Dox濃度提升死亡比例上升。

iQue® 在iPSC研究中的應(yīng)用

除Incucyte® 的應(yīng)用外，高通量的研究當(dāng)然少不了我們的iQue® 高通量流式細(xì)胞儀，專為大規(guī)模篩選設(shè)計。

2020年時，阿斯利康改良Crisper-cas9技術(shù)，開發(fā)了一種ObLiGaRe強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)型SpCas9(ODInCas9)轉(zhuǎn)基因小鼠模型，靶向ObLiGaRe導(dǎo)致人類或小鼠細(xì)胞的功能整合，最終產(chǎn)生ODInCas9小鼠，并且驗證發(fā)現(xiàn)這種小鼠體細(xì)胞體內(nèi)編輯可以模擬非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 腺癌，使治療研究能夠驗證候選藥物的功效。在判斷基因編輯成功與否時，應(yīng)用到Incucyte® 檢測細(xì)胞增殖，并聯(lián)合使用iQue® 及Incucyte® 篩選GFP陽性的細(xì)胞^[10]。

圖4. 高通量篩選編輯成功的GFP陽性細(xì)胞：

將各種不同組織細(xì)胞以及iPSC細(xì)胞導(dǎo)入OdInCas9，抗生素篩選后進(jìn)行單克隆挑選培養(yǎng)，用Incucyte® 拍照成像，識別GFP陽性細(xì)胞，為確定是否真正導(dǎo)入OdInCas9，加入Dox誘導(dǎo)GFP表達(dá)，細(xì)胞消化后放入96孔板，用我們的iQue® 鑒別GFP陽性細(xì)胞。

除此之外， 賽多利斯對兩者在iPSC中的應(yīng)用做了一個簡單的示例（圖5）：

圖5. iPSC檢測實驗流程：

1.多能性檢測：iQue® 檢測iPSC細(xì)胞系多能性標(biāo)記基因表達(dá)并用Incucyte® 檢測細(xì)胞形態(tài)；

2.2D培養(yǎng)時，利用Incucyte® 拍照，iQue® 檢測表面標(biāo)記基因表達(dá)；

3.3D培養(yǎng)21天后，以同樣方法檢測。

而下圖就是一個很好的案例。

圖6. 優(yōu)化培養(yǎng)基長期培養(yǎng)特征評估：

我們加入一種基礎(chǔ)培養(yǎng)基以及一種優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)ATCC-DYS0100 iPSC細(xì)胞系，并檢測這兩種情況下的生長狀況、形態(tài)以及標(biāo)記基因表達(dá)（圖5），可以看到陰性對照（非多能細(xì)胞）THP1細(xì)胞表達(dá)高水平SSEA-1，低表達(dá)TRA-1-60，陽性對照NCCIT細(xì)胞恰恰相反（圖6 A），優(yōu)化過培養(yǎng)基在長期培養(yǎng)到18天時，仍然保持著很強(qiáng)的多能性，而非優(yōu)化培養(yǎng)基隨著時間推移，逐漸分化。Forecyt分析軟件*的熱圖結(jié)果，清晰地展示18天時多能性標(biāo)記基因的表達(dá)比例（圖6 B），從而方便地實現(xiàn)大規(guī)模篩選。Incucyte® 對培養(yǎng)的擬胚體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)優(yōu)化過的細(xì)胞偏心度遠(yuǎn)低于未優(yōu)化組，更加圓潤（圖6 C,D），證明優(yōu)化過的培養(yǎng)基對于多能性的維持作用明顯。

展望未來，利用iPSC這種理想研究工具，可從成千上萬種的藥物中，發(fā)現(xiàn)藥物的新靶點、新作用，乃至發(fā)現(xiàn)新的藥物，誘導(dǎo)出真正替代人體成體細(xì)胞成熟度的細(xì)胞。

為什么要用Incucyte®長時程細(xì)胞影像分析系統(tǒng)？

為什么要用iQue® 高通量流式呢？

《活細(xì)胞監(jiān)測：優(yōu)化高級細(xì)胞模型的工作流程》

參考文獻(xiàn)

[1]Ding M, Clark R, Bardelle C, et al. Application of High-Throughput Flow Cytometry in Early Drug Discovery: An AstraZeneca Perspective[J]. SLAS discovery: advancing life sciences R & D, 2018, 23(7): 719–731.

[2]Zhou M, Wang H, Zeng X, et al. Mortality, morbidity, and risk factors in China and its provinces, 1990–2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017[J]. The Lancet, Elsevier, 2019, 394(10204): 1145–1158.

[3]Takahashi K, Yamanaka S. Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors[J]. Cell, 2006, 126(4): 663–676.

[4]Generation of human-induced pluripotent stem cells - PubMed[EB/OL]. /2022-09-30. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18600223/.

[5]Liu G, David B T, Trawczynski M, et al. Advances in Pluripotent Stem Cells: History, Mechanisms, Technologies, and Applications[J]. Stem Cell Reviews and Reports, 2020, 16(1): 3–32.

[6]Kim J, Koo B-K, Knoblich J A. Human organoids: model systems for human biology and medicine[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 2020, 21(10): 571–584.

[7]Pantazis C B, Yang A, Lara E, et al. A reference induced pluripotent stem cell line for large-scale collaborative studies[J]. bioRxiv, 2022: 2021.12.15.472643.

[8]Agbay A, Vega L D L, Nixon G, et al. Guggulsterone-releasing microspheres direct the differentiation of human induced pluripotent stem cells into neural phenotypes[J]. Biomedical Materials, IOP Publishing, 2018, 13(3): 034104.

[9]Davis J, Chouman A, Creech J, et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell–derived cardiomyocytes[J]. JCI Insight, , 6(10): e134368.

[10]Lundin A, Porritt M J, Jaiswal H, et al. ObLiGaRe doxycycline Inducible (ODIn) Cas9 system driving pre-clinical drug discovery, from design to cancer treatment[R]. Genomics, 2020.