趨化是細(xì)胞響應(yīng)化學(xué)刺激而產(chǎn)生的定向運(yùn)動，它在免疫細(xì)胞招募、創(chuàng)口愈合以及癌癥轉(zhuǎn)移等生理病理活動中起著重要的作用。因此，調(diào)控趨化的相關(guān)分子成為藥物研發(fā)中的重要靶點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)的趨化作用檢測方法往往受限于通量。Boyden是一種常用的細(xì)胞趨化研究工具，它由半透膜隔離形成兩個(gè)小室，細(xì)胞接種在上室，趨化因子加入下室，通過對遷移到半透膜下表面的細(xì)胞成像計(jì)數(shù)，可以定量趨化作用。
賽多利斯Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)配備了專門的趨化分析模塊，能夠在細(xì)胞培養(yǎng)箱中以96孔板的形式，實(shí)時(shí)可視化和自動定量分析細(xì)胞的趨化。
2018年百時(shí)美施貴寶（BMS）公司發(fā)表的一篇文章中就介紹了Incucyte® 對貼壁和懸浮細(xì)胞進(jìn)行趨化檢測方案。接下來，就讓我們一起來看看這個(gè)方案吧~
實(shí)驗(yàn)方法
圖1. Incucyte® 檢測用到的ClearView板（Sartorius，貨號 4582）由三部分組成：板蓋、小室和下室
在實(shí)驗(yàn)開始前，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求對小室的上下表面進(jìn)行包被。在上室中接種細(xì)胞并加入處理因素，在下室中加入趨化因子。將上下室組合后放入Incucyte® 系統(tǒng)中，并對小室的上下表面進(jìn)行連續(xù)成像。如上室接種的是懸浮細(xì)胞，其穿過8μm的半透膜直接進(jìn)入下室，則上室檢測到的細(xì)胞會逐漸減少。如上室接種的是貼壁細(xì)胞，其穿過半透膜后會黏附在小室的下表面，則下表面檢測到的細(xì)胞隨時(shí)間會增加。
圖2. Incucyte® 趨化檢測的流程示意圖
研究結(jié)果
單核細(xì)胞THP-1的趨化
CCR1是一種G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），表達(dá)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、DCs、破骨細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞。CCR1能與MIP-1α,RANTES 和leukotactin-1等趨化因子結(jié)合后誘導(dǎo)免疫細(xì)胞的活化和遷移，因此BMS將其作為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）的靶點(diǎn)，通過MIP-1α誘導(dǎo)的THP-1趨化實(shí)驗(yàn)篩選CCR1的抑制劑。
圖3A展示了不同濃度的MIP-1α加入下室作用16h后誘導(dǎo)遷移的THP-1細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果呈現(xiàn)倒U型模式，其擬合的EC50值為0.2nM（相較于傳統(tǒng)Boyden小室測得的EC50為0.1nM）。圖3B采用1nM MIP-1α作為趨化因子，同時(shí)加入不同濃度的CCR1拮抗劑——化合物6，在較高濃度的化合物6條件下，小室上表面未遷移的THP-1細(xì)胞更多，說明化合物6抑制THP-1細(xì)胞的趨化。圖3C比較了6個(gè)CCR1拮抗劑用Incucyte® 與傳統(tǒng)Boyden小室趨化檢測結(jié)果，顯示出良好的一致性。
圖3. CCR1拮抗劑對MIP-1α誘導(dǎo)的THP-1細(xì)胞趨化的影響
樹突狀細(xì)胞（DC）的趨化
樹突狀細(xì)胞（DC）可以攝取和處理抗原、并轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)將處理后的抗原遞呈給初始T細(xì)胞，是最有效的抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells, APC）。研究表明iDC（未成熟細(xì)胞）表達(dá)CCR1、CCR2、CCR5、CXCR1、CXCR2和CXCR4，而mDC（成熟細(xì)胞）則表達(dá)CCR7和CXCR4。
CCR1配體MIP-1α和CCR2配體MCP-1可以特異性誘導(dǎo)iDC細(xì)胞趨化，并且顯示出明顯的劑量依賴性（EC50分別為0.16nM和5.6nM，圖4A和B），而對mDC無作用。CCR1抑制劑——化合物1特異性抑制MIP-1α（4nM）誘導(dǎo)的iDC趨化，CCR2抑制劑——化合物7特異性抑制MCP-1（20nM）誘導(dǎo)的iDC趨化（兩者的IC50為1.3nM和1.1nM，圖4C和D，對應(yīng)傳統(tǒng)Boyden小室檢測結(jié)果是1.9nM和1.7nM）。
CXCR4的配體SDF-1α特異性誘導(dǎo)mDC細(xì)胞趨化（EC50為13nM，圖4E），CXCR4特異性拮抗劑AMD3100的IC50為21nM(圖4F).
圖4. DC細(xì)胞趨化檢測
實(shí)體腫瘤細(xì)胞的趨化
乳腺癌是一種高轉(zhuǎn)移性的常見癌癥，在正常乳腺組織中，CXCR4的表達(dá)較低；然而在原發(fā)乳腺腫瘤和轉(zhuǎn)移性乳腺癌里，CXCR4表達(dá)顯著增高，且與患者預(yù)后差相關(guān)。研究表明，CXCR4配體SDF-1α確實(shí)特異性誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的趨化（EC50為22nM，圖5A），CXCR4拮抗劑AMD3100抑制MDA-MB-231細(xì)胞的趨化（IC50為82nM，圖5B）。
圖5. MDA-MB-231細(xì)胞趨化檢測
T細(xì)胞的趨化
作為細(xì)胞免疫的重要組成部分，文章還研究了CXCR4配體SDF-1α對活化的T淋巴細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞Treg的趨化作用，對應(yīng)的EC50分別為33nM和22nM（圖6A和6C），CXCR4抑制劑AMD3100可以抑制兩種細(xì)胞的趨化，對應(yīng)的IC50為99nM和89nM（圖6B和6D）。
圖6. SDF-1α/CXCR4介導(dǎo)的 T 細(xì)胞趨化檢測
Incucyte® 趨化檢測的重復(fù)性
以SDF-1α介導(dǎo)的人急性T淋巴細(xì)胞CCRF-CEM趨化為例，分別用Incucyte® 與傳統(tǒng)Boyden小室方法定量檢測10種CXCR4抑制劑對CCRF-CEM趨化的影響，將兩種方法測得的IC50進(jìn)行相關(guān)性分析，其相關(guān)系數(shù)R2為 0.8（圖 7B）。在不同日期利用Incucyte® 進(jìn)行兩次獨(dú)立的趨化測定，其相關(guān)系數(shù)R2值為0.85（圖7C）。這均顯示了Incucyte®趨化實(shí)驗(yàn)結(jié)果的良好重復(fù)性。
圖7. Incucyte®趨化檢測的重復(fù)性
Incucyte® 高通量趨化檢測的自動化整合
前面THP-1、DC、T細(xì)胞和貼壁腫瘤細(xì)胞檢測的案例證明Incucyte® 趨化檢測的應(yīng)用廣、結(jié)果可信且重復(fù)性好，可用于癌癥轉(zhuǎn)移和免疫招募等相關(guān)疾病的藥物篩選中。雖然Incucyte® 趨化檢測相比傳統(tǒng)Boyden小室已實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測和自動定量，但整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中仍涉及孔板包被、稀釋、移液和孔板轉(zhuǎn)移等手動操作步驟，基于此，BMS利用實(shí)驗(yàn)室自動化整合了一個(gè)高效的流程來建立自動趨化檢測平臺（圖 8A）。以SDF-1α介導(dǎo)的Treg細(xì)胞趨化為例，8種CXCR4拮抗化合物自動和手動性檢測的IC50具有良好的相關(guān)性（R2為0.88，Z’因子為0.6，圖8B），說明該自動趨化檢測平臺的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性高。
圖8. 整合Incucyte® 的自動趨化檢測平臺
傳統(tǒng)的Boyden小室需要很高的接種細(xì)胞密度且是終點(diǎn)測定，需要用棉簽等去除小室內(nèi)未遷移的細(xì)胞，對小室下表面的細(xì)胞手動進(jìn)行固定、染色、成像和計(jì)數(shù)，步驟繁瑣。Incucyte® 小室內(nèi)半透膜孔的密度低，所需接種的細(xì)胞數(shù)更低，對于原代或分化來源的珍貴樣本更友好，且上、下室趨化因子的濃度差維持時(shí)間更長，可以進(jìn)行更長時(shí)程的檢測。Incucyte® 對小室的上下表面連續(xù)成像檢測，不需要摸索檢測時(shí)間點(diǎn)，可以導(dǎo)出已遷移和/或未遷移細(xì)胞的圖片或動態(tài)視頻，自動定量細(xì)胞遷移曲線，通過曲線斜率反應(yīng)細(xì)胞趨化的速度。整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程人為操作少，結(jié)果的準(zhǔn)確度和重復(fù)性好，且可以進(jìn)行自動化整合，實(shí)現(xiàn)更高通量的篩選需求（如下表）。
傳統(tǒng)Boyden小室 | Incucyte | ||
接種密度（細(xì)胞/孔） | 50,000 | 1,000（貼壁細(xì)胞） 5,000（懸浮細(xì)胞） | |
趨化因子濃度差維持時(shí)間 | 12-24h | 72h | |
自動連續(xù)檢測 | 否 | 可以 | |
細(xì)胞染色 | 需要 | 不需要 | |
自動定量 | 否 | 可以 | |
自動化整合 | 否 | 可以 | |
除了文中提到的T 細(xì)胞（Treg細(xì)胞、活化的T細(xì)胞）、iDC 、mDC、THP-1和 MDA-MB-231 細(xì)胞，BMS公司還構(gòu)建了包括B 細(xì)胞、mTh17、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、A549 和 NHLF細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞類型的Incucyte® 趨化檢測模型。這些模型被廣泛應(yīng)用于免疫、腫瘤、心血管和纖維化相關(guān)的多個(gè)藥物研發(fā)項(xiàng)目中。
為什么要用Incucyte® 實(shí)時(shí)活細(xì)胞分析系統(tǒng)呢？
培養(yǎng)箱內(nèi)可長達(dá)數(shù)周的連續(xù)觀察，最短幾分鐘間隔拍攝，減少人力，防止過多操作對細(xì)胞的傷害；只要放好您的細(xì)胞，其他交給Incucyte® 吧
6個(gè)板位，分別獨(dú)立設(shè)置檢測程序，可以兼容各種孔板和培養(yǎng)皿，通量高
高效簡便的模塊化軟件設(shè)置和數(shù)據(jù)分析，輸出圖片、視頻、生長曲線等多指標(biāo)多參數(shù)
大于100種優(yōu)化過的活細(xì)胞專用熒光試劑、耗材及詳盡的Protocol，文獻(xiàn)超過12000篇
-參考文獻(xiàn)-
Chen J, Ribeiro B, Li H, Myer L, Chase P, Surti N, Lippy J, Zhang L, Cvijic ME. Leveraging the IncuCyte Technology for Higher-Throughput and Automated Chemotaxis Assays for Target Validation and Compound Characterization. SLAS Discov. 2018 Feb;23(2):122-131. doi: 10.1177/2472555217733437. Epub 2017 Sep 28. PMID: 28957636.
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