2022年，哈佛大學和麻省理工學院團隊發(fā)表在Science期刊關于微生物群落研究方法學重要突破的研究成果宣告微生物單細胞時代正式開啟[1]。
這個在近年國自然基金項目中也被屢屢點名的微生物單細胞基因組學(SCG)提供了獲取稀有和暫無法培養(yǎng)微生物基因組的途徑微生物基因組學是宏基因組學的補充方法。由于單個微生物細胞中的基因組含量在飛克水平，如需進行全基因組擴增(whole genome amplification, WGA)，則最常見的WGA方法是單個微生物細胞基因組多重置換擴增法(multiple displacement amplification, MDA)，但該方法的成本昂貴，并且其對特定基因組區(qū)域的偏向性會降低高通量擴增效率，導致基因組擴增產物覆蓋不均勻。因此，獲得高質量細分細菌種群，特別是微生物群落中的少數(shù)成員的全基因組信息變得異常困難。
圖1. 不同的微生物單細胞基因組測序方法比較
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不同通過減少微生物單細胞測序反應體系總體積的方法比較
過往的研究發(fā)現(xiàn)減少WGA反應體系總體積的微縮化方法已被證明可以增加模板的濃度，并減少背景污染被放大的機會，改善微生物基因組DNA擴增產物的基因組覆蓋率和序列偏好均勻性的挑戰(zhàn)。如今，反應體積微縮化理念的方法已應用于各種不同的單細胞基因測序微流控裝置。
圖 2. 顏色代碼表示不同微流控裝置的相對優(yōu)勢，從綠色(優(yōu)勢較強) 到橙色，再到紅色(優(yōu)勢較小)。
Volume reduction approach: 反應體系微縮化方法;
Cell throughput: 細胞檢測通量;
Scale-up Flexibility: 反應體積放大靈活性;
Average Costs: 平均使用成本 ;
Fabrication complexity:操作復雜度
然而，并不是每一家實驗室都能自主研發(fā)或者具備一套以上原理的商業(yè)化系統(tǒng)，且這些系統(tǒng)擅長的應用場景是真核單細胞測序[2]。為應對這一挑戰(zhàn)，在一項富有創(chuàng)意的微生物單細胞基因組測序方法學改良前沿研究中，德國卡爾斯魯厄理工大學的研究人員知難而上，借助I.DOT MINI非接觸式自動化微量分液系統(tǒng)可實現(xiàn)納升級極限分液體積的性能，提出并證實了一種通過大幅減少基因組測序反應體系的MDA改良方法。結果發(fā)現(xiàn)該微縮化方法不但可以顯著降低測序成本，同時提高了常規(guī)384孔板中微生物基因組DNA擴增產物的基因組覆蓋率和序列偏好均勻性。
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改良的微縮化微生物單細胞基因組測序MDA法流程
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A
環(huán)境微生物樣品應立即進行實驗處理或利用冷凍保護劑深度冷凍以保持細胞的完整性
B
細胞通常用非特異性熒光染料染色，如DAPI或SYBR®Green或其他特異性標記如FISH
C
利用平臺或單個實驗室常見的單細胞分離技術將單個細胞物理分離到多孔板中
D
使用堿性緩沖液和凍融循環(huán)的組合將單個細胞裂解釋放基因組DNA
E
由于一個典型的原核微生物細胞只含極微量的飛克級基因組DNA，因此需要全基因組擴增(WGA)來產生足夠數(shù)量的DNA以制備文庫
F
一旦DNA文庫準備好，可以分別使用短讀長和/或長讀長基因組測序平臺進行測序
G
最后利用生物信息學對序列進行質量評價、裝配、分類、ORF調用和注釋
在以上微生物單細胞基因組測序MDA改良法步驟中：
I.DOT MINI非接觸式微量分液系統(tǒng)將微量裂解液分配到含細胞和不含細胞的培養(yǎng)板孔中(陰性對照)。在21℃下孵育10分鐘后再加入等體積的中和緩沖液。
在WGA測序文庫制備體系的步驟中，利用I.DOT MINI將測序反應主混合液(MasterMix)以nL至uL級的梯度分液體積分配到含裂解細胞孔和負對照孔，這樣最后的MDA反應總體積呈現(xiàn)為梯度的nL至uL級總體積500nL, 800nL, 1.0uL, 1.25uL, 5uL, 10uL。這些MDA反應體系在PCR儀中進一步孵化即得到擴增后的微生物單細胞基因組DNA模板用于測序文庫準備。
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改良的MDA法單細胞基因組測序結果
圖3. 改良MDA微生物單細胞測序結果統(tǒng)計
與WGA-X™等現(xiàn)有的方法相比，改良型MDA的微生物單細胞基因組覆蓋率取得了很大改進，以僅僅1.25uL反應體系的reads覆蓋了大腸桿菌基因組的85±13%，比其他總反應體積多覆蓋19% ~ 40%。在未改進的WGA-X™方法體系下10uL反應體系得到了36±21%的覆蓋率，與本改良方法中的10uL反應相比，改良方法比未改進方法的覆蓋廣度增加了約19%。這些結果表明，在1.25uL反應體積下進行的MDA大大改進了該方法，與標準的、更大的反應體積相比，可以產生更少的基因組偏差、更少的樣品污染和更完整的微生物基因組覆蓋度。
改良的反應體積微縮化MDA微生物單細胞基因組測序方法使得研究者僅需使用普通384孔板以及實驗室常規(guī)可用的單細胞分選設備，聯(lián)合I.DOT MINI非接觸式納升級微量分液系統(tǒng)的極限微量分液能力即可輕松實現(xiàn)。從未改良的標準50uL MDA反應中大幅降低了約97.5%的成本。另一方面，與微生物單細胞基因組測序通常使用的不低于100x測序深度相比，使用改良的測序反應體積微縮化的方法僅需40x測序深度便可實現(xiàn)高質量的微生物單細胞全基因組序列組裝。這種成本更為友好的改良型WGA-X™方法或將還有進一步降低成本的空間，激發(fā)更多科學家發(fā)起探索環(huán)境中稀有分類微生物群體和未知新型微生物基因組信息潛力的前沿研究。
-參考文獻-
[1] High-throughput, single-microbe genomics with strain resolution, applied to a human gut microbiome, Science, 2022
[2] A simplified improvement to multiple displacement amplification for microbial single-cell genomics, Int J Mol Sci, 2023
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