陳老師，空的傳感器怎么和分析物有非特異性吸附了？
有多少信號(hào)呢？
和有固化物的信號(hào)差不多呢
很多科研人員在分子互作實(shí)驗(yàn)中，常常會(huì)遇到非特異性結(jié)合的問(wèn)題，今天陳老師就跟大家聊一聊固液反應(yīng)中普遍存在的非特異性結(jié)合?；诠桃悍磻?yīng)的檢測(cè)方法有很多：如親和層析、免疫標(biāo)記技術(shù)（ELISA）、微陣列芯片技術(shù)、SPR、BLI等。本文所使用的數(shù)據(jù)均來(lái)自基于Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)的生物層干涉技術(shù)（BLI）固液反應(yīng)技術(shù)。
Q1
什么是非特異性結(jié)合？
提到非特異性結(jié)合，有兩個(gè)含義：一是固化物與分析物之間的結(jié)合，但是這種結(jié)合并不是我們期望的。另外一個(gè)是指不發(fā)生在分析物與固化物質(zhì)之間的反應(yīng)。今天我們討論的是如何消除后者意義上的非特異性結(jié)合。而這種非特異性其中又包含了兩層意思：
分析物直接與去除固化物的固相介質(zhì)結(jié)合
分析物緩沖液中其他物質(zhì)（雜質(zhì)）與有固化物的固相結(jié)合
圖1. a)分析物結(jié)合到空白傳感器；b)分析物緩沖液的組分結(jié)合固化物
Q2
非特異性作用使如何產(chǎn)生的？
1 分析物與介質(zhì)之間的靜電作用：常用的介質(zhì)（如海藻酸和葡聚糖）在特定的pH下會(huì)帶有大量電荷。如果分析物帶有相反電荷，就容易形成基于庫(kù)侖力的靜電作用。
2 分析物與介質(zhì)之間的疏水作用：如果雜質(zhì)或分析物是蛋白質(zhì)或帶有疏水基團(tuán)的化合物，而基質(zhì)也是蛋白質(zhì)（比如鏈霉親和素傳感器），就可能形成基于疏水作用的非特異性吸附。
3 分析物與固化物之間的生物相似性：在基于捕獲的固化反應(yīng)中，分析物帶有與固化蛋白相同的標(biāo)簽。比如，用帶有His抗體的基質(zhì)固化His標(biāo)簽的蛋白，但如果分析物中有相同的標(biāo)簽，就很難避免His標(biāo)簽的分析物直接與固相反應(yīng)。
4 雜質(zhì)的作用：在諸如血液、細(xì)胞裂解液等粗樣品中，雜質(zhì)產(chǎn)生的非特異性作用很普遍。一個(gè)典型的案例就是牛血清白蛋白（BSA）。作為一種常用的封閉試劑，由于來(lái)源和純化工藝的不同，一些廠商提供的BSA可能會(huì)帶有一定量的牛免疫球蛋白。
圖2. 用proA傳感器檢測(cè)IgG，因?yàn)榫彌_液中的BSA中含有牛免疫球蛋白，從而造成了很高的背景
Q3
如何減輕或者消除非特異性吸附？
solution 1
降低分析物濃度
這種情況適合于有固化ligand的傳感器與分析物信號(hào)大大高于無(wú)ligand傳感器，但是非特異性信號(hào)依舊明顯。比如，1000nM和500nM的分析物濃度下有非特異性信號(hào)，而250nM沒(méi)有，則把最高濃度改成250nM即可。
圖3. 左圖為高濃度結(jié)合曲線，右圖為降低濃度后結(jié)合曲線。綠色為有固化傳感器與分析物，黑色為同樣分析物濃度下非特異性信號(hào)。
優(yōu)點(diǎn)：不需要太多優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，操作簡(jiǎn)單。
缺點(diǎn)：使用條件有限。而且分析物濃度降低后，可能導(dǎo)致結(jié)合信號(hào)降低，可能需要延長(zhǎng)結(jié)合時(shí)間或者提高固化ligand的信號(hào)。
solution 2
增加封閉步驟或優(yōu)化分析緩沖液
這是去除非特異的主要方法。為什么將看似兩種方法放在一起呢？因?yàn)橥ǔＴ诖_認(rèn)了最佳封閉試劑后，會(huì)將其添加到分析緩沖液中。例如，如果1%的酪蛋白封閉效果最好，一般分析緩沖液中也會(huì)含有1%的酪蛋白。
然而，優(yōu)化緩沖液還包括增加鹽離子濃度、加入去污劑、調(diào)節(jié)pH等，具體見下表。
分析物緩沖液中一般加入tween20，濃度在0.02%—0.05%。
優(yōu)點(diǎn)：成本低，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一次性完成優(yōu)化。
缺點(diǎn)：可能會(huì)影響特異性結(jié)合，比如特異性結(jié)合主要依賴靜電作用，而非特異性也是靜電作用。如果提高鹽濃度，在降低非特異性的同時(shí)，特異性信號(hào)也降低了。因此，必須要用特異性信號(hào)與非特異性信號(hào)的比值來(lái)判斷優(yōu)化的效果。
下表顯示了在不同封閉緩沖液中，特異性信號(hào)（有固化物傳感器）與非特異性信號(hào)（無(wú)固化物傳感器）比值。使用Ni-NTA固相，可以看到在非特異性低的情況下，0.2%酪蛋白的封閉效果最好。
圖4展示了使用高濃度的鹽離子去除非特異性吸附。作者檢測(cè)CHO表達(dá)上清（粗樣品）中的EPO，發(fā)現(xiàn)固相與空載表達(dá)上清有很強(qiáng)的非特異性。然而，加入500mM的NaCl后，非特異性顯著降低。
圖4. 數(shù)據(jù)來(lái)自于Development of a VHH-Based Erythropoietin Quantification Assay.Mol Biotechnol，DOI 10.1007/s12033-015-9860-7
solution 3
更換固相的基質(zhì)或材料
首先需要明確在檢測(cè)步驟前固相上的基質(zhì)有幾層。例如，在雙抗夾心ELISA中，涉及到96孔板的材質(zhì)和第一個(gè)抗體等膜層。如果第二個(gè)抗體如果直接和這些膜層結(jié)合，就會(huì)發(fā)生非特異性吸附。此時(shí)，可以更換第一個(gè)抗體或者第二個(gè)抗體，甚至更換96孔板的材質(zhì)，以減輕非特異性吸附。
一些固相材料也可能由多層基質(zhì)組成，例如某些固相基質(zhì)主要是玻璃和氨基硅烷構(gòu)成，這些材質(zhì)上又鍍有鏈霉親和素或者海藻酸。如果與玻璃或者氨基硅烷有非特異性吸附，那么就只能用方法1、3、4去除非特異性吸附。如果與鏈霉親和素結(jié)合，可以更換基于海藻酸基質(zhì)的氨基偶聯(lián)的芯片。
優(yōu)點(diǎn)：可能從根本上去除非特異性吸附，并且保證特異性結(jié)合不受影響。
缺點(diǎn)：成本較大（比如SPR技術(shù)的金膜芯片），需要重新研發(fā)新介質(zhì)或者購(gòu)買新傳感器，并且很多傳感器介質(zhì)是個(gè)固定的，很難改變。
solution 4
固化物和分析物對(duì)換
（如果固化物非特異性吸附）
即固化之前的分析物，檢測(cè)固化物。
優(yōu)點(diǎn)：不需要準(zhǔn)備新的試劑或者耗材。
缺點(diǎn)：有些技術(shù)實(shí)現(xiàn)起來(lái)非常困難，比如基于微陣列的方法以及基于雙抗夾心的方法。
solution 5
盡可能去除分析物中的雜質(zhì)
比如，提高分析物的純度、提高緩沖試劑的質(zhì)量，或?qū)Υ謽悠愤M(jìn)行離心等簡(jiǎn)單處理。
優(yōu)點(diǎn)：可以順便提高純化和提取工藝。
缺點(diǎn)：耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，并且某些檢測(cè)的初衷就是檢測(cè)粗樣品。
solution 6
計(jì)算扣除法
即設(shè)置非特異性對(duì)照，并從所有數(shù)據(jù)均扣減非特異性信號(hào)。雖然這種方法有點(diǎn)“取巧”，但以下三種情況下可以使用計(jì)算扣除法：
A
在特異性信號(hào)遠(yuǎn)大于非特異性信號(hào)的時(shí)，可以采用這個(gè)方法。
B
分析物濃度很高（比如μM蛋白濃度以上），且難以通過(guò)優(yōu)化緩沖液和封閉方法去除非特異性信號(hào)的時(shí)候，可以嘗試使用計(jì)算扣除法。
C
在實(shí)時(shí)檢測(cè)反應(yīng)中（比如SPR、BLI技術(shù)），如果特異性反應(yīng)的結(jié)合解離特點(diǎn)與非特異性反應(yīng)完全不一樣的時(shí)候可以計(jì)算扣除，比如前者是快解離快結(jié)合，后者是慢結(jié)合慢解離的時(shí)候。
優(yōu)點(diǎn)：不需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化。
缺點(diǎn)：比較主觀，一般來(lái)說(shuō)非特異性信號(hào)會(huì)影響特異性信號(hào)。因?yàn)樯飿悠返亩鄻有?，非特異性是不可避免的。然而，只要按照上面的方法，先弄清非特異性的種類，再進(jìn)行針對(duì)性的合理優(yōu)化，還是可以有效地消除非特異性結(jié)合。
Octet®非標(biāo)記分子互作分析系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)
非標(biāo)記Direct Binding是趨勢(shì)，結(jié)果更準(zhǔn)確
快速測(cè)定親和力，更加定量化地表征分子互作
無(wú)洗滌步驟，可測(cè)弱親和力（解離快）
寫入了美國(guó)藥典，文章多，認(rèn)可度廣
萬(wàn)金油技術(shù)，可以用與檢測(cè)DNA，小分子，蛋白質(zhì)等各種生物分子
多種實(shí)驗(yàn)方案，除了直接測(cè)試，還有競(jìng)爭(zhēng)法，垂釣等
操作簡(jiǎn)便，耗材及維護(hù)成本低
《生物層干涉技術(shù)小分子應(yīng)用文集》
《生物層干涉技術(shù)小分子應(yīng)用文集》詳細(xì)介紹了生物層干涉（BLI）技術(shù)的原理，及其在小分子領(lǐng)域的多個(gè)應(yīng)用場(chǎng)景，并對(duì)BLI技術(shù)應(yīng)用于小分子研究的20余篇代表性文獻(xiàn)進(jìn)行了整理匯總：內(nèi)容涵蓋從防御機(jī)制到垂釣驗(yàn)證，再到小分子篩選、表征、優(yōu)化等多個(gè)方面，全展示了BLI技術(shù)在小分子研究中的強(qiáng)大潛力和實(shí)踐成果。
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