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基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP2/9）明膠酶譜法試劑盒說明書

描述：基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活性的酶原形式分泌，活化后能夠降解 細(xì)胞外基質(zhì)的膠原蛋白，又稱膠原酶。通過影響細(xì)胞外基質(zhì)，膠原酶參與胚胎發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、組 織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤、心血管、神經(jīng)等許多疾病過程。血漿與組織中的 MMP-2、MMP-9 參與各種生理與病理過程，其在研究診斷和治療中的意義日益受到重視   1。

本試劑盒采用酶譜法(zymography)檢測 MMP-2、MMP-9  活性。Zymography  是一種廣為使用的、基 于 SDS-PAGE 電泳和反相凝膠染色的蛋白酶檢測方法，其靈敏度可達(dá) 1 nM，高于 ELISA 方法 2，其 基 本原理和程序是：制備加有膠原酶底物的 SDS-PAGE 凝膠，含蛋白酶的樣品在此凝膠中進(jìn)行電 泳， 電泳結(jié)束后取出凝膠與酶反應(yīng) Buffer 孵育，凝膠染色與脫色。凝膠中由于含底物蛋白而被深 染，形 成深色背景，但在有蛋白酶條帶的位置，蛋白酶將降解凝膠中的底物蛋白，因而不被染色 而形成透 亮區(qū)域，從而能同時(shí)指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及活性。本試劑盒提供
MMP-2、MMP-9 特異蛋白底物及酶學(xué)反應(yīng)緩沖液，可檢測少至 0.1~0.5 μl 血液中的 MMP-2、MMP- 9 酶譜及活性，檢 測靈敏度~1 nM。試劑盒可進(jìn)行 50 次標(biāo)準(zhǔn)小膠檢測，如果小膠加樣孔為 10~15
個(gè)，則總計(jì)可檢測 500~750 個(gè)樣品。
適用: 檢測 MMP-2、MMP-9 酶譜及活性（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1 nM）。 組成與儲存 (50 assays)：
1.2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；
2.10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；
3. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；
4. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用時(shí)用蒸餾水稀釋；
5. SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液(#P1501), 4 oC。

檢測步驟：
1. 制備含 MMP 底物蛋白的 SDS-PAGE 凝膠：推薦分離膠濃度為 8%。按照標(biāo)準(zhǔn)程序制備 SDS- PAGE 凝膠。將 10 × substrate G 融化，并 90 oC 加熱 5 分鐘。分別在濃縮膠和分離膠中額外加 入 10 × substrate G 并使之稀釋 10 倍，混勻后加入過硫酸銨和 TEMED，等待凝膠聚合。
2. 待測樣品 1:1 稀釋于 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混合后直接上樣。切勿加熱變性，并且僅 使用不加還原劑的上樣緩沖液?？赏ㄟ^預(yù)試驗(yàn)確定加樣量，使用普通蛋白預(yù)染  Marker   即可。陽 性對照(可選步驟)：可取人、小鼠、大鼠或兔 100μl 全血與 100μl 2 × SDS-PAGE non-
reducing buffer 等體積混合，取 5-15μl 上樣。
3. 低電流恒流電泳，每一塊小膠電流為 20    mA/gel。溴酚藍(lán)跑出凝膠前沿時(shí)結(jié)束電泳。
4. 洗滌凝膠：取出凝膠，去除濃縮膠，放入容器內(nèi)?？上扔眠m量蒸餾水沖洗凝膠，然后加入  10    ml
1× Buffer A(用蒸餾水稀釋)，室溫漂洗凝膠 2 × 30 分鐘。中間換液。
5.  孵育：倒掉 Buffer A。加入 10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫或 37oC 孵育 1~5 小時(shí)。陽性 對 照或者血中的 MMP 通常 37oC 孵育 1 小時(shí)即可顯示。如 MMP 活性低，應(yīng)延長孵育時(shí)間為 10 小時(shí)。
6.  顯色：倒掉 Buffer B，加入 SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液（操作步驟見 SDS-PAGE 凝 膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書）。凝膠的大部分區(qū)域被深染，在有 MMP 條帶的位置 不被染 色而形成透亮區(qū)域。透明區(qū)域的位置和范圍指示 MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及 活性。陽 性對照將在 66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa 位置出現(xiàn)透 明條帶。
7. 條帶掃描：將凝膠放在掃描儀上掃描。雖然 MMP 條帶透明，但凝膠背景并非真正全黑。解決 辦法：可用非透射光掃描，或用軟件圖像處理程序調(diào)整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(shè)置為黑 色。MMP      條帶則為白色，這種背景黑條帶白的格式是英文論文中zui常見的格式。

說明
1. 10 mM 能夠 EDTA *抑制 MMP 活性。
2. 凝膠干燥：可使用聚丙烯酰胺凝膠干膠裝置(#P2000)室溫快速干燥凝膠，作為*記錄保留。

參考文獻(xiàn)：
1.Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494
2.Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102, 196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)考馬斯亮藍(lán)染色液說明書 P1501

常規(guī)考馬斯亮藍(lán) SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhì)染色是實(shí)驗(yàn)室常用的凝膠染色方法。銀染方法雖然靈敏度 高，但所需試劑復(fù)雜并且有毒有害，操作步驟繁瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：
1. 此染色液即為工作液，使用時(shí)直接將聚丙烯酰胺凝膠放在培養(yǎng)皿中以考馬斯亮藍(lán)染色液覆蓋凝 膠，并緩慢搖動 2h；
2. 傾去染色液，用脫色液沖洗凝膠；
3. 以脫色液覆蓋凝膠，緩慢搖動 2h，傾去脫色液，再加入新脫色液進(jìn)行脫色，直至獲得清晰的 藍(lán)色的條帶和干凈的背景（通常此過程需要 2～4h，也可脫色過一夜至清晰的藍(lán)色的條帶和干凈 的背景）；
4. 對凝膠進(jìn)行分析和照相，凝膠可放置在    7％的乙酸中保存。也可用凝膠干膠裝置（P2000）對 凝膠進(jìn)行處理后保存。
安全性：含有甲醇，無特殊毒性，按一般化學(xué)品操作規(guī)程處理。 說明：
1. 染色液配方：0.25g 考馬斯亮藍(lán) R250+420ml 甲醇+100ml 冰乙酸，定容至 1000ml，混合 1h 后用 Whatman 1 號濾紙過濾，于室溫可無限期保存；
2. 脫色液配方：冰醋酸:甲醇:水＝7:5:88（V:V:V）；
3. 保存液：7％冰醋酸；
4. 凝膠染色之后，染色液可以回收利用，裝入新容器內(nèi)，室溫或 4 oC 保存，可反復(fù)使用 2-4 次。