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GENMED 細(xì)胞培養(yǎng)基谷氨酰胺比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書（中文版） 主要用途
GENMED 細(xì)胞培養(yǎng)基谷氨酰胺比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫酶的雙酶循 環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)基樣品中的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）的消耗量，即采用比色法測(cè) 定其氧化后峰值的變化，進(jìn)行測(cè)算谷氨酰胺含量的而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)由大師級(jí)科學(xué)家精心研 制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于細(xì)胞培養(yǎng)前和培養(yǎng)中的各種細(xì)胞培養(yǎng)基中谷氨酰胺的檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌， 即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定。
技術(shù)背景
L-谷氨酰胺是構(gòu)成人體蛋白質(zhì)所必需的20種氨基酸之一。是人體內(nèi)zui普遍的、不可缺乏的條件性必需氨基 酸，是構(gòu)成蛋白質(zhì)*的氨基酸之一，更是某些細(xì)胞培養(yǎng)中zui基本的元素。由于谷氨酰胺不穩(wěn)定的特 性，在細(xì)胞培養(yǎng)基的整合中，易自發(fā)性分解為谷氨酸和氨離子，而氨離子對(duì)細(xì)胞的毒性很強(qiáng)，因此，在細(xì) 胞培養(yǎng)體系中，須密切關(guān)注谷氨酰胺的儲(chǔ)存壽命（SHELF LIFE）和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。在谷氨酰胺酶和谷氨酸脫氫 酶的雙酶循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)中，L-谷氨酰胺首先發(fā)生脫氨基反應(yīng)，產(chǎn)生谷氨酸和氨離子；進(jìn)一步氨與2-酮戊二 酸反應(yīng)再次產(chǎn)生谷氨酸，同時(shí)將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADPH）氧化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide phosphate；NADP+），即測(cè)定NADPH（340nm 波長(zhǎng)）的濃度變化，來定量分析谷氨酰胺的含量， 其反應(yīng)方式為：
產(chǎn)品內(nèi)容
GENMED 緩沖液（Reagent A） 毫升 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B） 微升 GENMED 陰性液（Reagent C） 毫升 GENMED 酶促液 I（Reagent D） 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 微升 產(chǎn)品說明書 1 份
保存方式
保存 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B）、GENMED 酶促液 I（Reagent D）和 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 在－20℃冰箱里，其余的保存在 4℃冰箱里；GENMED 反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；有效保證 6 月
用戶自備
無離子水：用于溶解樣品 過濾紙：用于樣品澄清處理 封口膜：用于樣品密封
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15 毫升錐形離心管：用于制備樣品的容器 比色皿：用于比色的容器 96 孔酶標(biāo)板：用于比色的容器 分光光度儀：用于比色分析 酶標(biāo)儀：用于微量樣品比色分析
實(shí)驗(yàn)步驟
實(shí)驗(yàn)開始前，將－20℃冰箱里的試劑盒中的 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B）、GENMED 酶促液 I（Reagent D）和 GENMED 酶促液 II（Reagent E）置入冰槽里融化。GENMED 反應(yīng)液（Reagent B）避免光照；同 時(shí)設(shè)定好分光光度儀（溫度為 25℃）：波長(zhǎng) 340nm，并置零。然后進(jìn)行下列操作。 一、（選擇操作）樣品準(zhǔn)備（注意：參見注意事項(xiàng)4） 1． 移取 5 毫升待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基到 15 毫升錐形離心管 2． 放進(jìn)臺(tái)式離心機(jī)離心 10 分鐘，速度為 1500g 3． 移取上清液到新的 15 毫升錐形離心管 4． （選擇步驟）可以加入適量的用戶自備的無離子水稀釋（如果 L－谷氨酰胺濃度過高） 5． （選擇步驟）過濾紙過濾（如果離心處理，樣品仍然不清澈） 6． 封口膜封口備用 二、背景對(duì)照定 1． 移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 xx 微升 GENMED 陰性液（Reagent C） 3． 加入 xx 微升 GENMED 酶促液 I（Reagent D） 4． 上下傾倒數(shù)次，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘 6． 放進(jìn)分光光度儀，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B） 9． 上下傾倒數(shù)次，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進(jìn)分光光度儀測(cè)讀（此為初始讀數(shù)） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下傾倒數(shù)次，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（此為終點(diǎn)讀數(shù)） 16．實(shí)際讀數(shù)（初始讀數(shù)－終點(diǎn)讀數(shù)）：此為背景空對(duì)照實(shí)際讀數(shù) 三、樣品總活性測(cè)定 1． 移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 25 微升上述制備的待測(cè)樣品（注意：樣品須清澈）
3． 加入 xx 微升 GENMED 酶促液 I（Reagent D）
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4． 上下傾倒數(shù)次，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘 6． 放進(jìn)分光光度儀，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B） 9． 上下傾倒數(shù)次，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進(jìn)分光光度儀測(cè)讀（此為初始讀數(shù)） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下傾倒數(shù)次，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（此為終點(diǎn)讀數(shù)） 16．實(shí)際讀數(shù)（初始讀數(shù)－終點(diǎn)讀數(shù)）：此為樣品總活性讀數(shù) 四、 樣品非特異活性測(cè)定 1． 移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到新的比色皿 2． 加入 25 微升上述制備的待測(cè)樣品（注意：樣品須清澈） 3． 加入 xx 微升 GENMED 陰性液（Reagent C） 4． 上下傾倒數(shù)次，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘 6． 放進(jìn)分光光度儀，置零 7． 取出比色皿 8． 加入 xx 微升 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B） 9． 上下傾倒數(shù)次，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進(jìn)分光光度儀測(cè)讀（此為初始讀數(shù)） 12．加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．上下傾倒數(shù)次，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（此為終點(diǎn)讀數(shù)） 16．實(shí)際讀數(shù)（初始讀數(shù)－終點(diǎn)讀數(shù)）：此為樣品非特異活性讀數(shù) 五、 計(jì)算樣品濃度： [（樣品總活性讀數(shù)－樣品非特異活性讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù) Xxx（毫升，測(cè)定容量）]÷[xx（樣 品容量，毫升）Xxx（毫摩爾吸光系數(shù)）]＝微摩爾/毫升÷（樣品重量）毫克/毫升＝微摩爾/毫克 六、 酶標(biāo)板測(cè)定 1． 在 96 孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照、樣品總活性、樣品非特異活性 2． 分別移取 xx 微升 GENMED 緩沖液（Reagent A）到相應(yīng)孔中
3． 按下表分別加入：
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背景對(duì)照孔
樣品總活性孔
樣品非特異活性孔
GENMED 陰性液（Reagent C）
微升
――
微升
待測(cè)樣品
――
微升
微升
GENMED 酶促液 I（Reagent D）
微升
微升
――
4． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻 5． 室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 6． 放進(jìn)酶標(biāo)儀，置零 7． 取出酶標(biāo)板 8． 分別加入 xx 微升 GENMED 反應(yīng)液（Reagent B） 9． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻 10．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 11．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀測(cè)讀（此為初始讀數(shù)） 12．取出酶標(biāo)板，分別加入 xx 微升 GENMED 酶促液 II（Reagent E） 13．輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板，混勻 14．室溫下（溫度為 25℃）靜置 5 分鐘，避免光照 15．即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照和樣品讀數(shù)（此為終點(diǎn)讀數(shù)） 16．實(shí)際讀數(shù)：初始讀數(shù)－終點(diǎn)讀數(shù) 17．濃度計(jì)算： [（樣品總活性讀數(shù)－樣品非特異活性讀數(shù)－背景讀數(shù)）X 樣品稀釋倍數(shù) X xx（毫升，測(cè)定容量）]÷[xx（樣 品容量，毫升）X xx（毫摩爾吸光系數(shù)）X 0.6]＝微摩爾/毫升÷（樣品重量）毫克/毫升＝微摩爾/毫克
注意事項(xiàng)
1． 本產(chǎn)品為 21 次（10 個(gè)樣本）操作，包括背景對(duì)照 2． 操作時(shí)，須戴手套 3． 本產(chǎn)品檢測(cè)范圍在 0 至 50 微克/毫升（0 至 350 微摩爾）谷氨酰胺 4． 如果樣品含有過高的脂質(zhì)和蛋白成分和過深的色素，建議進(jìn)行樣品澄清處理（去色、去脂、去蛋白、 去氣體等）；本公司提供 GENMED 谷氨酰胺待測(cè)樣品處理試劑盒－GMS19027.6 5． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需 1 次 6． 樣品須澄清，至關(guān)重要 7． 反應(yīng) 5 分鐘后比色測(cè)定值趨于穩(wěn)定；測(cè)定值由高到低變化；如果仍有波動(dòng)，建議適當(dāng)延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間， 直至讀數(shù)穩(wěn)定 8． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗* 9． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度 10．本公司提供系列營(yíng)養(yǎng)學(xué)元素檢測(cè)試劑產(chǎn)品
質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定