液體樣本甘油含量測(cè)定試劑盒

描述：甘油是甘油三酯的水解產(chǎn)物。脂蛋白酯酶能夠水解血液中的甘油三酯；胰脂酶可以水解食物中的甘油三酯；激素敏感脂肪分解酶能夠水解脂肪細(xì)胞中的甘油三酯。與游離脂肪酸一樣，甘油含量是甘油三酯水解反應(yīng)的可靠檢測(cè)指標(biāo)，但檢測(cè)更加方便。本試劑盒采用甘油磷酸氧化酶法與經(jīng)典的GPO-Trinder 酶學(xué)反應(yīng)方法，通過(guò)比色測(cè)定液體樣本中的甘油含量。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，操作步驟更加簡(jiǎn)單，檢測(cè)線性范圍在10-1200µmol/L，可靠性和重復(fù)性俱佳，適合生物醫(yī)學(xué)、食品實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

原理：在 ATP 存在下甘油被甘油激酶磷酸化為 3- 磷酸甘油，再被甘油磷酸氧化酶氧化產(chǎn)生過(guò)氧化

氫；在過(guò)氧化物酶作用下生色底物轉(zhuǎn)化為苯醌亞胺，其光密度值與甘油濃度成正比。

 適用范圍：測(cè)定血液，細(xì)胞培養(yǎng)基、體液、酒類飲料中的甘油濃度。

 組成： (105 次微板測(cè)定或 30 次 1 ml 比色杯測(cè)定)：

(1) R1 試劑 40 ml

(2) R2 試劑 10 ml

(3) 4 mmol/L 甘油標(biāo)準(zhǔn)品 1 ml ，4 ℃，儲(chǔ)存6 月。

操作步驟：

一 樣本處理：

1.       酒類、飲品、清澈液體樣本：可直接進(jìn)行測(cè)定，如超過(guò)線性范圍可用蒸餾水或生理鹽水稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。

2.       培養(yǎng)液：取不含酚紅、無(wú)顏色、無(wú)血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，如有細(xì)胞碎片應(yīng)4ºC,，12,000g離心5min,取上清進(jìn)行測(cè)定。

3.       血液：對(duì)于新鮮抗凝血而言，可4ºC，2,000g離心5min得到血漿；而對(duì)于非抗凝血來(lái)說(shuō)，可先4ºC靜置2h得到血清后，2000g離心10min,除去血細(xì)胞。將得到的血漿/血清70ºC 加熱10分鐘滅活內(nèi)源脂肪酶，12,000g離心10min ,去上清進(jìn)行測(cè)定或-20ºC保存。

二 工作溶液配制：按4:1比例，取4 ml試劑R1與1 ml試劑R2混合即可，立即使用或4ºC保存<1天，變色棄去。

 三 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用蒸餾水、生理鹽水或與樣品緩沖液一致的液體，將4 mM甘油標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125 µmol/L，通常取其中4~6管即可，注意設(shè)置0濃度對(duì)照反應(yīng)管。

四 甘油濃度測(cè)定：

1.       加樣。為使反應(yīng)時(shí)間盡量一致，減小實(shí)驗(yàn)誤差，可先加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品，然后再加入工作溶液。（注意：當(dāng)甘油濃度較低時(shí)，可將待測(cè)樣品與工作溶液按照100µl:100µl體積進(jìn)行混合，然后再進(jìn)行測(cè)定，但是如果樣品體積超過(guò)100µl時(shí)將會(huì)稀釋工作液中酶的濃度，致使反應(yīng)靈敏度下降。如果待測(cè)樣品濃度超過(guò)線性范圍的時(shí)候，可進(jìn)行適當(dāng)稀釋，然后根據(jù)稀釋倍數(shù)來(lái)計(jì)算樣品中甘油濃度。）

2.       37ºC或25ºC反應(yīng) 15分鐘。反應(yīng)平衡后顏色在60分鐘內(nèi)穩(wěn)定。

3.       先用蒸餾水+工作液的空白管調(diào)零，然后測(cè)定各管OD值。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算甘油濃度。附Excel作圖步驟：各標(biāo)準(zhǔn)管OD值為y軸，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為x軸。(1)鼠標(biāo)左鍵圈住數(shù)據(jù)，點(diǎn)擊做圖向?qū)?，選擇-散點(diǎn)圖-，點(diǎn)擊-完成-。(2)鼠標(biāo)右鍵點(diǎn)圖上的某一點(diǎn)，點(diǎn)擊-添加趨勢(shì)線-，點(diǎn)擊-選項(xiàng)-，點(diǎn)擊-顯示公式-和-R²值-。