動物樣品的采集及處理方法
遺傳學(xué)數(shù)據(jù)在野生動物和圈養(yǎng)動物的保護(hù)和管理中變得日益重要。在本文中，我們總結(jié)了一些能簡便而有效地獲得樣品及數(shù)據(jù)的方法。
我們在采集樣品之前，對將要進(jìn)行的遺傳學(xué)分析有所了解。然而，采集者并非都是研究者，當(dāng)采集地與實(shí)驗(yàn)室有相當(dāng)距離時，采集者常常要保存好樣品直到有合適的接受者或存放地，這就要求采集者應(yīng)具備一定的經(jīng)驗(yàn)。
首先，所有樣品均應(yīng)以個體序號進(jìn)行標(biāo)注，并且應(yīng)寫上種名、性別、采樣者姓名以及采集日期，越詳盡越好，以便同一個體的不同類數(shù)據(jù)可以相互引用，另外，地理來源的標(biāo)注也很重要，需要注明。對于野外捕獲的動物，有條件者在地圖上標(biāo)明捕獲地及其經(jīng)緯度。對圈養(yǎng)動物的每個野外捕獲種源都要有同樣的記錄和詳盡的譜系圖，因?yàn)樽V系圖可用于計(jì)算近交系數(shù)。
總之，背景資料越詳細(xì)越好，即使不能得到這里所列的全部信息，也要盡可能詳盡。
7.l．1 樣品的測量方法
在一定數(shù)量的分類群中采用的標(biāo)準(zhǔn)測量方法可用于以下四個方面：
（1）分類學(xué)上：一套理想的測量方法應(yīng)能大致上重建機(jī)體每個主要硬件部分的形狀和大小。
（2）不對稱性分析：機(jī)體各部分的起伏不對稱，也許表明進(jìn)化過程在一定程度上正在變得不穩(wěn)定，這可能是環(huán)境壓力或近交的結(jié)果。測量不對稱時機(jī)體左右兩部分均應(yīng)考慮在內(nèi)。
（3）遺傳變異：在科級水平上，如果對同一年齡的個體采用同樣的測量方法，就有可能對所選特征中的遺傳成分變異進(jìn)行粗略的估計(jì)。雖然并非總是能做到這樣，但能使遺傳學(xué)家對所選特征（如生殖特征方面遺傳變異的任何丟失）進(jìn)行監(jiān)視。
（4）生理檢測或記錄：采用標(biāo)準(zhǔn)測量方法得到的記錄，也許會有助于與用其他手段得到的數(shù)據(jù)起來分析。例如，如果有了精子形態(tài)的記錄，或是特殊寄生物的感染記錄，遺傳學(xué)家就能因此尋找在不同群體中這些因素與變異水平的相關(guān)性。
7.1．2 組織樣品的采集和保存
下面詳細(xì)給出針對不同研究目的的適當(dāng)方法。當(dāng)然，每個實(shí)驗(yàn)室都有各自習(xí)慣的組織處理方法，因此，本文僅給出快速保存的有關(guān)要求，但對每種組織的可用性都有所評述，以便在用途有沖突時，能對潛在數(shù)據(jù)的可能應(yīng)用作出迅速判斷。
使用腫瘤、毛發(fā)及精子樣品，保存時應(yīng)特別注意。使用細(xì)胞培養(yǎng)樣品可減少對活體或新殺動物的依賴，如果培養(yǎng)物來源于腫瘤組織細(xì)胞，則可大量減少對同種動物組織的進(jìn)一步需求。組織材料必須在數(shù)小時內(nèi)送到有關(guān)實(shí)驗(yàn)室或用于其他的細(xì)胞培養(yǎng)。如果已經(jīng)知道DNA 序列的一小部分，就可利用PCR 技術(shù)從很少一部分組織中擴(kuò)增DNA，從而使極其的樣品（如一根毛發(fā)或單個精子）具有更高的利用價(jià)值和更大的可信度。
組織必須取自活體動物或死后1～2 分鐘內(nèi)的動物，并且要快速保存起來，除非出現(xiàn)下述情況：在野外條件或是匆忙安排的活體取樣，因此沒有時間同實(shí)驗(yàn)室。此時要有目的地?cái)U(kuò)大采集和儲存量。如果已經(jīng)詳細(xì)知道樣品的確切用途，則有時條件可以放寬。例如，對血液樣品來說，有些酶是不要求立即凍存的?？焖賰龃鏁r樣品可放人液氮、干冰中或直接放入－70℃冰箱。凍存樣品可在—70℃液氮、冰箱、干冰或－20℃冰箱中保存和運(yùn)輸。樣品凍存及運(yùn)輸均以放入液氮中效果較好。非凍結(jié)冰箱是不能用的。
7．1．2．l 用于染色體研究的軟組織的處理
室溫下將全部或部分樣品浸入0．9％的生理鹽水中，在數(shù)分鐘內(nèi)將樣品送至實(shí)驗(yàn)室，zui遲也要在1～2 小時之內(nèi)送到。
研究染色體能看到有絲分裂和減數(shù)分裂，從而了解有關(guān)染色體倒位等現(xiàn)象。染色體倒位會影響到受精和遺傳重組，可能的同性個體應(yīng)從染色體方面進(jìn)行檢查，但對哺乳動物來說，通常不需要研究同性別的染色體。
7．1．2．2 用于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的組織的處理
通常來源于幼體動物的組織用于細(xì)胞培養(yǎng)較好。在一個個體中，癌組織和肺組織是的，但其他軟組織也可以用。
細(xì)胞培養(yǎng)常用的是新鮮組織，但捕殺幾天后的動物組織仍能用來培養(yǎng)。總之，樣品越快到實(shí)驗(yàn)室，成功的可能性就越大。
如果取樣時需切開活體動物的皮膚，則應(yīng)當(dāng)在無菌的條件下進(jìn)行。對細(xì)胞培養(yǎng)來說，無
菌條件下進(jìn)行進(jìn)一步的處理也是很有必要的，而在野外這是難以做到的。因此，一個不透風(fēng)的封閉空間以及面具、手套是很有用的，至少操作人員應(yīng)離開工作臺面遠(yuǎn)一些。所有的臺面、試劑瓶、手套、儀器等使用前要用70％的酒精消毒。所用的試劑應(yīng)是新鮮的，如果對其無菌性有任何懷疑（如變渾濁或變顏色）就應(yīng)倒掉。
在無菌條件下將組織樣品放入0％的酒精中，搖動1 分鐘后，將樣品轉(zhuǎn)人收集液中，在室溫下放置1～4 天。如需放置更長時間，則兩天后須將組織樣品轉(zhuǎn)到運(yùn)輸液中，就可再于室溫下存放幾天。轉(zhuǎn)移過程中無菌操作是很重要的，因?yàn)檫\(yùn)輸液中一般不使用防腐劑。
收集液和運(yùn)輸液一般由接受樣品的實(shí)驗(yàn)室提供。成纖維細(xì)胞培養(yǎng)可生產(chǎn)出更多的材料而不必再從動物中取，達(dá)到事半功倍的效果。
7．1．2．3 用于染色體研究的血樣的采集
采血樣須無菌操作。采血用的注射器、小瓶等應(yīng)用肝素潤濕。有些用品買來時就已經(jīng)用肝素處理過。迅速將血樣送往實(shí)驗(yàn)室（在低溫條件下但不使其凍結(jié)）。如果條件不允許，可在無菌條件下，每 0．lml 血樣加 5ml 的血樣處理液，然后在室溫下轉(zhuǎn)送到實(shí)驗(yàn)室（實(shí)驗(yàn)室會有另一種準(zhǔn)備好的處理液）。
7．1．2．4 用于酶及其他蛋白質(zhì)研究的軟組織的處理
將軟組織切成1cm 見方的小塊，包好并迅速凍存。如將組織塊浸泡在2％的苯甲醛中，在室溫下放置，某些酶的活性可保持幾個月（Nakanishi 等1969）。一些魚類蛋白質(zhì)可以用市場買來的材料進(jìn)行分析，但這里的目的是區(qū)分種，而不是為了獲得詳盡的遺傳數(shù)據(jù)。
7．1．2．5 用于酶和蛋白質(zhì)研究的血樣的采集
試驗(yàn)所用的注射器、試管等應(yīng)用肝素包被（是鋰鹽），或者是用低溫保存的肝素潤濕。如果可能的話，所有溶液配制等操作均應(yīng)在5℃條件下快速完成。對于較大體積的樣品（＞5ml），將紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血漿分開。首先在1000r／min 離心10 分鐘，快速吸取血漿，迅速分裝凍存。然后吸出漂浮在紅細(xì)胞表面的一層白細(xì)胞帶，再用5～10 倍體積的PBS 將紅細(xì)胞洗兩次后離心，zui后將片狀沉淀物快速凍存。
白細(xì)胞層用ACK 溶解（0．15mol／dm３ 氯化銨、0．01mol／dm３ 碳酸氫鉀、0．lmol／dm３ Na２ EDTA），直到變成澄清的紅色（約 5 分鐘）。在 500r／min 離心 5 分鐘后，小心吸去 ACK 和紅細(xì)胞碎片，剩下的白細(xì)胞會重新懸浮于 ACK 中。2 分鐘后，細(xì)胞成團(tuán)沉淀，此時再用 PBS 洗。如果沉淀物仍為紅色，則將整個過程重復(fù)一次，而后將其凍存。白細(xì)胞（酶的來源）也可以通過將等分血樣鋪展于20％的Ficoll、4．5％Na２ EDTA中的方法，使其沉降（10～15 分鐘），再用巴氏吸管從界面吸取白細(xì)胞，于1000r／min 離心10 分鐘，而后凍存。用 Ficoll 分離的紅細(xì)胞很難再復(fù)原。
有些蛋白質(zhì)可以用其他方式保存的血樣進(jìn)行分析：①保存于5℃并在幾小時內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室的；②凍存的全血（未處理過）；③全血或經(jīng)分離的血樣稀釋于3 倍體積的苯甲醛中，并保存于室溫下。蛋白質(zhì)電泳是用于研究種群內(nèi)遺傳多樣性或分類學(xué)差異的方法。同其他脊椎動物相比，哺乳動物血樣并非是很好的酶和蛋白質(zhì)的來源，有時取軟組織更好。
7．l．2．6 用于核DNA 研究的軟組織的保存
將組織切成1cm 見方的小塊，包起來凍存?；?qū)⑵浞湃霂妆扼w積的80％乙醇（分析
純）中，于4℃下存放。兩種方法中以前一種方法更好。
7．l．2．7 用于核DNA 研究的血樣的保存保存血樣可用占血樣體積0．01 倍的15％ K２EDTA 作為抗凝劑，并且能夠加入0．05倍的蛋白酶K（0．1％，核酸級，Boehringer Mannheim 冰凍保存，用新解凍的），充分混合后迅速凍存。血與EDTA 混合液可在室溫下放置幾天，但DNA 的質(zhì)量不會太好。
DNA 技術(shù)可以分析幾乎所有組織樣品基因組的任何一部分，從而能夠克服用蛋白質(zhì)研 究變異及分類學(xué)時出現(xiàn)的有關(guān)問題。
7．1．2．8 用于制備DNA 的毛發(fā)及精子樣品的保存
雖然以前從干燥或用福爾馬林固定的毛發(fā)及精子樣品中提取過DNA，但zui可靠的保存方法是凍存（Impraim 等 1987；Thomas 等 1990）。必須注意的一點(diǎn)是，盡可能地減少其他來源的DNA 對樣品的污染，特別是實(shí)驗(yàn)者的手，因?yàn)镻CR 反應(yīng)對微量DNA 是很敏感的。較好的做法是儀器經(jīng)烘烤（180℃過夜）或火焰消毒，其他所用的每一件東西（手套、試管、工作臺面）用一套新的、經(jīng)γ射線消毒處理的商業(yè)化產(chǎn)品。精子樣品也可以用來作常規(guī)的遺傳分析，如不需要人工控制交配就可進(jìn)行連鎖研究（Li 等1988）。當(dāng)然，精子樣品還可用于人工授精，這在圈養(yǎng)動物的遺傳管理上是很重要的。
7．1．2．9 用于提取線粒體DNA 的軟組織及血樣的保存
將樣品在4℃下保存，并盡快送到實(shí)驗(yàn)室。血樣貯存于有葡萄糖檸檬酸包被的真空管中時，可以凍存幾年（在液氮中），但解凍后只能在室溫下保存幾天時間。線粒體DNA 的分析對研究物種在地理分布上的變異及構(gòu)建譜系尤其有用。
7．1．2．10 用于提供RNA 的軟組織的保存
RNA 會在極短的時間內(nèi)被破壞，因此必須在動物死亡或活檢后1～2 分鐘內(nèi)迅速將其切成1cm 的小塊，并放人液氮中凍存。
RNA 可用于 DNA 文庫的構(gòu)建，它能為遺傳學(xué)家提供探針，用于個體總DNA 中單個活性基因的分析。雖然來源于其他動物的探針也能用，但用同種的探針效果。
7．2 動物組織DNA 樣品的提取
目前提取高分子量的DNA 的方法已有很多，我們在這一部分中除了介紹常規(guī)的DNA提取方法外，還將著重討論由微量樣品（如毛發(fā)）和陳舊古老樣品提取DNA 的一些新方法。
7．2．l 提取動物總DNA 的常規(guī)方法
從動物組織中提取DNA 的常規(guī)步驟如下：
（1）取動物組織100mg 左右于樣品管中，用干凈的剪刀將組織塊剪碎。
（2）在樣品管中加入如下試劑：
500μl STE 溶液
25 μl 蛋白酶 K（Proteinase K，10 mg／ml）
75μl 10％ SDS
（3）混勻后置56℃下消化2 小時以上（隔一定時間混勻一次）。
（4）加人等體積的飽和酚溶液，輕輕顛倒混合5 分鐘以上（用于rDNA 和RAPD 分析的樣品需抽提24 小時）。
（5）7 000r／min 離心5 分鐘。
（6）小心將上層清液移至另一干凈的離心管中，加入等體積的苯酚及氯仿，并重復(fù)步驟（4）和（5）的抽提過程。
（7）以等體積的氯仿（內(nèi)含1／25 體積的異戊醇）重復(fù)步驟（4）和（5）的抽提過程。
（8）在上清液中加入 1／10 體積的 3mol／dm３NaAc 或 5mol／dm３NH４Ac、2 倍體積的冷無水乙醇或1 倍體積的異丙醇，以沉淀DNA。
（9）置—70℃下沉淀2 小時或置—20℃下沉淀過夜。
（10）7 000r／min 離心10 分鐘，再以 70％冷乙醇洗滌DNA 沉淀一次。將沉淀置真空干燥器或37℃溫箱中干燥。
（11）以適量的TE 溶液（200～500μl）溶解DNA 樣品。
（12）以分光光度計(jì)測定DNA 的濃度（260nm），260／280nm 的光密度比值應(yīng)在 1．8 以上，否則提示可能有蛋白質(zhì)或苯酚的污染。
（13）以TE 溶液將DNA 樣品稀釋成所需的工作液的濃度。
（14）取2μl 左右的樣品進(jìn)行電泳檢測，以判斷 DNA 是否有降解以及是否需要消除RNA。
7．2．2 微量動物組織樣品的總DNA 提取方法
從微量組織中提取DNA 的方法是1989 年由Singer-Sam（Walsh 等1991）發(fā)展起來的。此方法的基本原理是采用 BioRad Chelex 100（一種螯合劑）提取DNA。此方法簡便、快速，提取后的DNA 樣品可以直接作為PCR 的模板。具體的操作步驟如下：
（1）取一小塊冰凍的組織（少于1mg，可用經(jīng)消毒的槍頭鉆?。?，或1～3 根帶有毛根的毛發(fā)（需先經(jīng) 90％、70％的乙醇和滅菌水依次清洗，并剪去毛干部分），或 1～5μl 血液，加入經(jīng)過高溫消毒的離心管中。離心管內(nèi)事先加入 500μl 5％的Chelex 溶液。
（2）將樣品管在56℃下放置1 小時或更長時間，直至組織樣品成粉末狀（不同組織所需時間各不相同）。
（3）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。
（4）在 95～100℃下煮 15～40 分鐘。
（5）在振蕩器上振蕩10～15 秒鐘。
（6）將樣品管在4℃下保存，進(jìn)行PCR 反應(yīng)之前再次離心，使Chelex 顆粒沉淀。取上清液（1～10μl）作為DNA 模板。
7．2．3 陳舊、古老DNA 樣品的提取方法
對于陳舊、古老DNA 的研究始于80 年代中期。1985 年，Paabo 采用克隆的手段從古
埃及木乃伊中提取并測定了一段DNA 序列。然而，較為廣泛地開展對古老DNA 的研究是在多
聚酶鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)（PCR）發(fā)明以后才開始的（Mullis，F(xiàn)allona 1987）。
經(jīng)過一定時期的物理、化學(xué)作用（幾十年至幾百萬年）的DNA 往往存在比較嚴(yán)重的降解，DNA 片段常常僅有幾百個bp 的長度，并且可能存在堿基的修飾和一些抑制PCR 反應(yīng)的物質(zhì)。因此，在從陳舊或古老樣品中提取DNA 時，zui為關(guān)鍵的問題就是防止現(xiàn)代DNA 的污染。進(jìn)行DNA 提取操作的所有器皿、器械和試劑均要進(jìn)行滅菌處理，提取過程應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行。此外，提取時應(yīng)設(shè)陰性對照，以監(jiān)測是否存在外源DNA 的污染。下面介紹的是一種較為簡便的提取方法。
（1）取樣品少許（如哺乳動物的皮張可取 1cm × 1cm 見方的小塊），用剪刀、手術(shù)刀等器械對樣品表面進(jìn)行處理，除去zui容易遭受外來污染的表層。對于骨骼、琥珀等堅(jiān)硬的樣品則需要用小鋼鉆等特殊器械從內(nèi)部取得樣品。
（2）經(jīng)過表面處理的樣品用90％乙醇、70％乙醇和去離子水依次進(jìn)行清洗。
（3）在滅菌的 Eppendorf 管中加入 200μl 去離子水、10μl 蛋白酶K（10mg／ml）和 1／10 體積的（20μl）10％的β-巰琉基乙醇。處理過的樣品放入上述溶液前要盡可能剪碎。
（4）在56℃下消化48 小時。
（5）樣品管中加入等體積的5％～10％的Chelex100 溶液，在旋渦混合器上振蕩5～10秒鐘，然后在98℃下放置20～60 分鐘。
（6）振蕩混合5～10 秒鐘，并使之冷卻至室溫。
（7）12 000r／min 離心 5～10 分鐘。
（8）小心取出上層清液，置另一干凈的管中保存。
7．3 植物總DNA 的提取
1976 年，Millgan 用Blin 和Stafford 描述的方法分離了植物DNA，然而這些DNA 是不能用于克隆的。在發(fā)明了去除植物DNA 上污染物的方法之后，人們可用分離動物組織DNA 的方法分離植物DNA。去除植物帶電高分子污染物的方法有核分離（Bickle 等1977）。CTAB（十六烷基*基溴化銨）分離（Murray，Thompson 1980）和鹽酸／十二烷基肌氨酸鈉分離（Sung，Slightom 1981）等。在這些方法中，CTAB 方法因簡便、快速而使用zui廣泛。收集和保存植物組織的方法對于 DNA 的產(chǎn)量和質(zhì)量也有很大影響。雖然已能成功地從植
物標(biāo)本和化石中分離出 DNA（Doyle，Dickson 1987），但采用新鮮材料能產(chǎn)生的結(jié)果，特別是對于產(chǎn)生大量單寧、酚或其他次級代謝產(chǎn)物的種。如材料不能馬上進(jìn)行提取，應(yīng)保存在冷而濕的地方，例如在冰盒中。如有必要可以冷凍保存。如果沒有條件，在無水CaSO４瓶中快速干燥（Liston 等 1990）。DNA 的提取應(yīng)盡快進(jìn)行，以防其降解（Pyle，Adams1989）。
提取DNA 的過程中有許多因素能導(dǎo)致DNA 降解。首先是物理因素。因?yàn)镈NA 分子量較大，機(jī)械張力或高溫很容易使DNA 分子發(fā)生斷裂。因此，在實(shí)際操作過程中應(yīng)盡可能輕緩，盡量避免過多的溶液轉(zhuǎn)移及劇烈的振蕩等，以減少機(jī)械張力對DNA 的損傷，同時也應(yīng)避免過高的溫度。其次，細(xì)胞內(nèi)源DNA 酶及細(xì)胞破裂釋放的次級產(chǎn)物也會導(dǎo)致DNA 降解。所以在提取DNA 的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)計(jì)了許多可供選擇的分離緩沖液，以適應(yīng)不同的植物材料。分離緩沖液的pH 值有時需要進(jìn)行改進(jìn)，pH 應(yīng)避免接近降解酶的zui適點(diǎn)。大多數(shù)降解酶和脂肪氧合酶pH 值的zui適點(diǎn)在 5．0～6．0 之間，而DNA 酶pH 值zui適點(diǎn)在 7．0 左右（Dunham，Bryant 1963）。由于在過酸的條件下，DNA 脫嘌呤會導(dǎo)致DNA 的不穩(wěn)定，極易在堿基脫落的地方發(fā)生斷裂，所以大多植物DNA 提取緩沖液的pH 值為8．0，有的甚至為9．0。緩沖液中包含了大量的復(fù)合物，如 EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基硫酸鈉）、牛血清白蛋白（BSA）、β-巰基乙醇、谷胱甘肽、二硫蘇糖醇（DTT）、抗壞血酸（Vc）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、二乙基焦碳酸鹽（DEPC）、溴化乙錠（EB）等（Hallick等1977）。但由于上述物質(zhì)有些是抑制內(nèi)切酶和非特異性核酸酶的，所以在其后的步驟中要將其除去。分離DNA 與蛋白質(zhì)一般采用苯酚－氯仿抽取的方法。苯酚、氯仿對蛋白質(zhì)均有*的變性作用，而對DNA 無影響。下面的方法描述DNA 與污染物多糖的分離，也可用陰離子交換層析儀來進(jìn)行。下面列出了3 種常見的分離植物總DNA 的方法。3 種方法溶解細(xì)胞膜和分離蛋白質(zhì)的方法不同，各有其優(yōu)、缺點(diǎn)。
7．3．1 CTAB 緩沖液方法
這是zui廣泛地用來分離植物DNA 的方法，對大多數(shù)植物種都適用，特別是當(dāng)樣本數(shù)量很小時。此法運(yùn)用陽離子去污劑CTAB 溶解植物細(xì)胞膜，并與DNA 形成一復(fù)合物。其優(yōu)點(diǎn)是不需要準(zhǔn)備大量的植物組織，而且適合像葉、根、種子、胚、胚乳、花粉和懸浮培養(yǎng)的組織等多種類型的組織（Rogers，Bendch 1985）。另外，此法對樣品數(shù)量的要求也不高，從小到毫克數(shù)量的標(biāo)本（木乃伊、化石）到許多克的新鮮材料均可使用（Golenberg 等 1990；Rogers Bendch 1985）。
7．3．l．1 CTAB 的實(shí)驗(yàn)方法
1．材料
（1）2 倍CTAB 緩沖液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0
1．4mol／dm３NaCI
20 mmol／dm３EDTA
2％ CTAB（W／V）
1％ PVP-360（W／V）
0．2％ß-巰基乙醇（體積比，用前在通風(fēng)櫥中加）
（2）清洗緩沖液：
76％乙醇
10 mmol／dm３乙酸銨
（3）懸浮緩沖液：
10 mmol／dm３乙酸銨
0．25 mmol／dm３EDTA，pH 值 8．
2．步驟
（1）加熱分離緩沖液、研缽、研杵到60℃。
（2）在熱研缽中放人0．5～1．5g 新鮮或冰凍的葉子，用7．5ml 2 倍CTAB 分離緩沖液研磨（可加些石英砂幫助研磨）。對凍干的組織用1 倍CTAB 緩沖液研磨。把研碎的組織倒入50ml 管中，再用0．5ml 2 倍CTAB 緩沖液沖洗研缽，將沖洗液加到管中。
（3）將試管在60℃下放置30～60 分鐘，然后輕輕振蕩，使之充分混合后降至室溫。
（4）在試管中加入10ml 氯仿－異戊醇（24:1）萃取液（如顏色深可再進(jìn)行一次），輕輕搖晃使其混合，在室溫下1500r／min 離心5 分鐘，使其分相。
（5）將上層的水相倒入－15ml 管中，加2／3 體積的冷異丙醇，輕輕混合以沉淀核酸。如果看不到核酸沉淀，可在－20℃下放置20 分鐘或更長時間。
（6）室溫下 800r／min 離心 3～5 分鐘，如果看不到小團(tuán)或沉淀，可在－20℃下放置 20分鐘再離心。
（7）小心地倒掉上清液，不要倒掉核酸，這時的核酸一般松散地貼在管的底部，加 15ml清洗緩沖液，輕輕地旋轉(zhuǎn)清洗沉淀物，15～20 分鐘后核酸將變得更白。
（8）室溫下800r／min 離心5 分鐘（如不充分，則加大離心速度或延長離心時間），倒掉清洗緩沖液，將管倒扣在紙巾上，讓沉淀物干燥，小心不要讓DNA 滑掉。
（9）按沉淀物的大小用少量懸浮緩沖液（10～100 μl）懸浮DNA。
（l0）用100μg／ml RNAase 在 37℃下溫育 30～60 分鐘。
（11）如果組織包含單寧或其他次級產(chǎn)物，可以對 DNA 作進(jìn)一步純化（可用氯仿、苯酚純化）。一些材料可能需要用氯銫（CsCl）梯度純化。上述方法也可以進(jìn)行改進(jìn)，像巰基乙醇的濃度可以提高至 25mmol／dm３，也可加入 l％的抗壞血酸、DTT 等，CTAB 也可用 SDS 取代（Golenberg 等1990），也可用 TE（10mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8.0，lmmol／dm３EDTA）作懸浮緩沖液。
7．3．l．2 CTAB 沉淀法
1．材料
2 倍CTAB 分離緩沖液；沉淀緩沖液：
100 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；20 mmol／dm３EDTA；2％CTAB（w／V）。
2．步驟
（1）與7．3．1．1 中前4 個步驟同。
（2）吸取上層水相，將其例入一個15ml 管中。
（3）加 3 倍體積的沉淀緩沖液，使NaCI 的濃度減少到 0．35mol／dm３，室溫下放置 30分鐘。
（4）室溫下 2 000r／min 離心 5 分鐘，以沉淀 DNA。
（5）根據(jù)沉淀物的大小，用少量的懸浮緩沖液（10～100μl）懸浮DNA。
（6）雖然氯仿或苯酚提取DNA 是有效的，但是對那些包含單寧或其他次級產(chǎn)物的組織，可以在氯化銫梯度上進(jìn)一步純化。
7．3．2 蛋白質(zhì)沉淀方法
這個方法可以產(chǎn)生高質(zhì)量的DNA，但產(chǎn)量也是zui低的。一般在沉淀核酸之前用乙酸鉀沉
淀蛋白質(zhì)和多糖（Dellaporta 等1983；Galau 等1988；Hughes，Galau 1988）。此方法不需要有機(jī)提取，而且快速，所以對大量樣品比較合適。
1．材料
提取緩沖液：100mmol／dm３ Tris-HCI，pH 值8．0；50mmol／dm３EDTA，pH 值8．0；500mmol／dm３ NaCl；2％SDS（w／v）；l％PVP-360（w／v）；0．1％β-巰基乙醇（體積比），用之前在通風(fēng)櫥中加。
2．步驟
（1）用液氮在研缽中研磨1．0g 新鮮葉子，可以加一些石英砂幫助研磨。將研磨完畢的粉末貯存在－80℃冰箱中，在加提取液之前，不要讓植物材料融化。
（2）在冰凍的組織中加 6ml 提取緩沖液，轉(zhuǎn)到一個15ml 的離心管中，充分振蕩大約30 秒鐘，使之混合均勻，然后在65℃下放置20 分鐘。
（3）往管中加入2ml 5mol／dm３乙酸鉀（pH 值6．5），充分搖勻，在冰水中放置5 分鐘。隨著不溶的十二烷基硫酸鉀的沉淀，大部分蛋白質(zhì)和多糖作為復(fù)合物被除去了。
（4）在 4℃下 2 000r／min 離心 20 分鐘。
（5）吸出上清液，將其倒入一個干凈的 15ml 的離心管中，不要帶入顆粒物質(zhì)，然后加 4ml 異丙醇輕輕混合，在－20℃下放置。
（6）在4℃下 2 000r／min 離心 15 秒鐘，DNA 沉淀后，輕輕地倒掉上清液，在紙巾上倒扣10 分鐘或更長時間，以干燥沉淀物。
（7）將沉淀物放在 100TE 中溶解，然后將溶液倒入一個1．sml 離心管中，離心 5分鐘，移去不溶的沉淀。
（8）將管中上清液倒入另一個 1．5ml 離心管中，加 75μl 3mol／dm３ NaAc（pH 值 7．6）和500μl 冷異丙醇，充分混合，在—20℃下放置1～2 小時，拿出后再在室溫下放10 秒鐘，使管中DNA 沉淀。
（9）用 500μl 80％乙醇洗沉淀物 10 分鐘，離心 1 分鐘，干燥沉淀物 10 分鐘。
（10）根據(jù)DNA 沉淀物的大小，用少量的 TE（10～100μl）溶解DNA。
7．3．3 氯化銫方法
這個方法的原理是根據(jù)在氯化銫（CsCl）中的不同密度梯度來分離細(xì)胞成分。此方法可以產(chǎn)生大量高純度的DNA，但費(fèi)時，而且需昂貴的儀器設(shè)備，對需要復(fù)雜的有機(jī)提取或沉淀的材料比較適合（Carr，Griffith 1987；Weeks 等 1986）。在一些情況下，它可能是在含大量次級產(chǎn)物的植物中提取高質(zhì)量DNA 的*方法。DNA 可以在一個平衡的CsCl 梯度中通過與以下幾個染料中的一個結(jié)合而被純化， 這幾個染料為溴化乙錠（ Ethidium bromide）、Bisbenzimicle、碘化丙錠（propidium iodide）、Bisbenzimide，它們不同的浮力密度對分離不同的染色體組特別有用。
7．3．4 PCR 小量制備法
此方法的優(yōu)點(diǎn)是一次可以提純很多樣品，比較快速，而且小于10mg（50mm）的新鮮葉子材料就可以產(chǎn)生足夠的DNA，產(chǎn)生的DNA 對雜交實(shí)驗(yàn)是可用的（Millgan 1992）。這個方法存在的問題是DNA 沉淀物可能不夠緊密，或不一定能形成一緊密的DNA 沉淀。
1. 材料
分離緩沖液：200 mmol／dm３Tris-HCI，pH 值 8．0；250 mmol／dm３NaCI；25 mmol／dm３EDTA；
0．5 ％ SDS。
2．步驟
（1）用1．5ml 離心管研磨小的組織樣品。可取管口大小的新鮮葉子（＜10mg），凍在液氮中
的葉子也可用。
（2）在研碎的樣品中加 400μl 的分離緩沖液，用適合的速度渦旋 10 秒鐘，以分散開樣品。
（3）在室溫下將1．5ml 離心管中樣品離心 12～15 分鐘，沉淀細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。
（4）搜集300μl 的上清液，棄去沉淀。
（5）在上清液中加300μl 預(yù)冷異丙醇，倒轉(zhuǎn)樣品1～3 次，使之充分混合，在室溫下至少放
置5 分鐘。
（6）將微離心管中的樣品在室溫下離心20 分鐘，以搜集沉淀的DNA。
（7）棄去上清液，用300μl 80％的乙醇室溫下沉淀 10 分鐘。
（8）室溫下離心樣品12 分鐘，棄去上清液。
（9）用300μl 80％的乙醇再洗后，室溫下離心 5 分鐘，棄去上清液。
（10）室溫下干燥樣品1 小時或?qū)悠贩胚^夜。
（11）用 100μl TE 懸浮樣品。
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