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使 用 說 明 書
2005年2月7日 谷氨酸脫羧酶抗體酶聯(lián)免疫測(cè)定試劑盒 -96人份檢測(cè)- 試劑代碼 3802 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)人血清中 谷氨酸脫羧酶的自身免疫抗體（GAD6bs） MEDIPAN GMBH
有的生產(chǎn)許可證包括US 5,512,447 和 EP 0502188.
I 型糖尿病又稱胰島素依賴型糖尿病（IDDM），主要由于分泌胰島素的胰腺β細(xì)胞的慢性自身免疫性損傷所致。很可能是由于環(huán)境因素作用與易感基因缺陷人群，而誘發(fā)此病。當(dāng)胰腺β細(xì)胞的80-90%被損傷時(shí)，臨床狀況才出現(xiàn)。在*癥狀出現(xiàn)前，這個(gè)細(xì)胞損傷的程序可能要持續(xù)好幾年，并且此病可發(fā)生在任何年齡及任何時(shí)間。 在臨床癥狀出現(xiàn)前的階段，針對(duì)于β細(xì)胞抗原的自身抗體出現(xiàn)在血液循環(huán)中，預(yù)示著此類疾病的出現(xiàn)。象胰島素抗體（IAA），谷氨酸脫羧酶（GAD抗體和酪氨酸磷酸酶抗體（又稱ICA512或IA2抗體）這些自身免疫抗體，在I型糖尿疾病初發(fā)或臨床癥狀出現(xiàn)前就已經(jīng)存在多年。GAD是一種催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為GABA的酶，GAD已經(jīng)被識(shí)別有2種分子量分別為65.000（GAD65）和67.000（GAD67）的同工酶。盡管GAD自身抗體被發(fā)現(xiàn)在I型糖尿病患者和極少數(shù)的神經(jīng)紊亂Stiff-man綜合癥（SMS）患者體內(nèi)，但GAD自身抗體在此2種病患者體內(nèi)的連接形式是不同的。 SMS患者體內(nèi)的自身抗體識(shí)別一種線性的和三維空間的結(jié)構(gòu)GAD抗原，而在I型糖尿病患者體內(nèi)的GAD65自身抗體只識(shí)別三維結(jié)構(gòu)的抗原。在近期的患者診斷中，在70-80%的I型糖尿病患者體內(nèi)可檢測(cè)出GAD65自身抗體（GAD65 Abs）。 GAD65自身抗體和IA2自身抗體的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)于兒童和成人的I型糖尿病危險(xiǎn)性的評(píng)估有很好的相關(guān)性。 ANTI-ICA與ANTI-GAD聯(lián)合檢驗(yàn)比單獨(dú)使用ANTI-ICA診斷I型糖尿病更加敏感，更有判定性，比如在I型糖尿病的檢測(cè)方面。 GAD也出現(xiàn)在一些II型糖尿病病人中，患者多有顯著的高血糖?；颊咴诮邮芸诜堤撬幬镏委煄讉€(gè)月甚至幾年后，他們可能會(huì)變成胰島素依賴型患者。因此，此類病人被認(rèn)為是一種漸進(jìn)型的I型糖尿病患者。我們常稱這種疾病為隱性疾病或成人隱性自身免疫疾病。 此類病人血清中的GAD65抗體的存在是將來胰島素依賴性的一個(gè)敏感和特異的標(biāo)志。
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谷氨酸脫羧酶抗體檢測(cè)試劑是一個(gè)酶聯(lián)免疫方法的分析試驗(yàn)，用于定量檢測(cè)人血清內(nèi)的谷氨酸脫羧酶自身免疫抗體（GAD65 Abs）。 本試驗(yàn)體系利用GAD65抗體的二價(jià)性，在固相的GAD65和液相的GAD65-生物素之間形成一個(gè)橋。首先，來自于樣本的GAD65抗體結(jié)合到包被有GAD65的微孔盤上。其次，GAD65-生物素結(jié)合到這個(gè)復(fù)合物上。這個(gè)結(jié)合上的GAD65-生物素的量與樣本中的GAD65抗體的含量相關(guān)。未結(jié)合的GAD65-生物素通過清洗被去除。結(jié)合的GAD65-生物素可通過加入的鏈霉素過氧化酶來定量，再加入呈色底物（TMB），zui后在波長(zhǎng)450nm下讀取光密度。
樣本的收集和保存 通過靜脈取血。血液凝集后，通過離心分離血清。必要使用脂血或嚴(yán)重溶血的血清樣本。不可以使用血漿檢測(cè)。 樣本可在2-8oC保存zui多3天，長(zhǎng)期保存要求放置于-20oC。 避免反復(fù)凍融血清樣本。如果要多次使用，在zui初使用時(shí)將樣本等量分配為幾分，保存于-20oC。
所需材料 - 的移液器 10 - 100 µl - 多道移液器 - 可棄移液頭 - 8腔道清洗器或微盤清洗機(jī) - 濾光波長(zhǎng)為450nm及620nm或690nm的酶標(biāo)儀 - 量筒 - 蒸餾水或去離子水 - 吸水紙或紙巾 - 薄片 規(guī)格和保存 谷氨酸脫脫羧酶抗體診斷試劑為96人份檢測(cè)試劑?？蓹z測(cè)40份未知樣本以及雙孔標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控血清。 每一個(gè)組分的有效日期標(biāo)示于各自的標(biāo)簽上，試劑盒的有效期標(biāo)示于盒簽上。 試劑盒的所有組分必須保存在2-8oC, 建議放入原始的試劑盒內(nèi)保存。 使用前的試劑制備 試驗(yàn)前請(qǐng)將樣本恢復(fù)到室溫。小心地輕輕晃動(dòng)血清樣本，使其混合均勻。 請(qǐng)小心的處理下列組分: 微孔盤（A）- 在打開微孔盤之前使其恢復(fù)室溫。沒有使用的盤子應(yīng)該保存在冰箱內(nèi)，并且要保存在原包裝袋中封閉好，以避免濕氣，如此可保存16周。 濃縮清洗液（B）– 配制充足用量的洗液，用去離子水或蒸餾水按照1+9（濃縮洗液B+水）的比例稀釋洗液。例如：50ml的濃縮洗液（B）+450ml的蒸餾水。稀釋前的洗液不應(yīng)該有結(jié)晶，否則用37oC溫水將其溶解。稀釋后的洗液可在2-8oC保存30天。 鏈霉素過氧化酶（D） – 配制充足用量的鏈霉素過氧化酶溶液，用鏈霉素過氧化酶結(jié)合物稀釋液G按照1+19（濃縮酶結(jié)合物D+稀釋液G）的比例稀釋。例如：0.25ml濃縮鏈霉素過氧化酶（D）+4.75ml稀釋液（G）。配制好的溶液在2-8oC穩(wěn)定16周。 底物液（E） – 底物液（E）避光保存。 GAD65-生物素（H）– 配制充足用量的GAD65-生物素溶液，在試驗(yàn)前用5.5mlGAD65-生物素稀釋液（J）直接加入到1瓶?jī)龈傻腉AD65-生物素（H）中。配制好的溶液在2-8oC穩(wěn)定3天。
建議作雙孔重復(fù)測(cè)試 1. 根據(jù)試驗(yàn)安排將下列液體加入相應(yīng)孔中。 - 25 µl 陰性質(zhì)控品 （C I） 和各標(biāo)準(zhǔn)品 （1 - 5） - 25 µl 病人樣本 和質(zhì)控血清 （C II）. 2. 將盤子覆蓋，放置室溫（18 - 25 °C）溫育 60分鐘，同時(shí)震蕩，振速>500rpm. 3. 吸去孔內(nèi)液體或?qū)⒈P子快速反扣在吸水紙上倒空液體，以除去孔內(nèi)的殘留物。用300ul 稀釋后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒鐘。 4. 每孔加入100ul重組的GAD65-生物素溶液。 5. 將盤子覆蓋，放置室溫（18 - 25 °C） 溫育60分鐘，同時(shí)震蕩，振速>500rpm. 6. 吸去孔內(nèi)液體或?qū)⒈P子快速反扣在吸水紙上倒空液體，以除去孔內(nèi)的殘留物。用300ul 稀釋后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒鐘。 7. 每孔加入100ul稀釋后的鏈霉素過氧化酶結(jié)合物溶液。 8. 將盤子覆蓋，放置室溫（18 - 25 °C） 溫育20分鐘，同時(shí)震蕩，振速>500rpm. 9. 吸去孔內(nèi)液體或?qū)⒈P子快速反扣在吸水紙上倒空液體，以除去孔內(nèi)的殘留物。用300ul 稀釋后的清洗液洗3次，每次浸泡5秒鐘。 10. 每孔加入100ul底物液（E），輕微震蕩。 11. 室溫避光孵育20分鐘。 12. 每孔加入100ul終止液（F）。振蕩5秒，振速>200rpm. 13. 加入終止液后5分鐘內(nèi)，以雙波長(zhǎng)450/620nm或450/690nm測(cè)量吸光度。 請(qǐng)注意清洗步驟是十分關(guān)鍵的。不充分的清洗將會(huì)導(dǎo)致精密度下降和不真實(shí)的吸光度評(píng)估數(shù)值。如果沒有振蕩，測(cè)得的吸光度值將會(huì)下降20%，并且會(huì)降低敏感度。
標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過將測(cè)量所得的1-5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD平均值為坐標(biāo)軸的y軸，將與其相對(duì)應(yīng)的1-5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度設(shè)為x軸，由此而得。另外陰性質(zhì)控品也應(yīng)該用于此標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。（見下） 根據(jù)測(cè)得的吸光度值，質(zhì)控品和未知樣本中所含的GAD65抗體的濃度（IU/ml）可以直接的從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得。 本試驗(yàn)結(jié)果分析也可以通過計(jì)算機(jī)分析軟件利用spline半對(duì)數(shù)曲線獲得.
請(qǐng)不要用此數(shù)據(jù)進(jìn)行試驗(yàn)評(píng)估
典型實(shí)例
正如我們通常建立其它的診斷參數(shù)那樣，對(duì)于anti-GAD65的血清抗體水平監(jiān)測(cè)，建議每一個(gè)實(shí)驗(yàn)室也要建立自己的正常范圍及病理學(xué)范圍。因此，上面給出的參考值范圍僅僅提供一個(gè)指導(dǎo)。
標(biāo)準(zhǔn) Madipan生產(chǎn)的谷氨酸脫羧酶抗體酶聯(lián)免疫法檢測(cè)試劑的標(biāo)準(zhǔn)依照WHO的參照制定方法NIBSC 97/550條，GAD65抗體的濃度單位為IU/ml. 線性 依據(jù)自身抗體人群的不同特質(zhì)以及考慮到抗原決定簇對(duì)自身抗體的特異性和親和力，在一些情況下，用陰性人血清稀釋GAD65抗體后測(cè)得的濃度與理論上所期待的濃度不相符。 特異性和敏感度 使用GAD65抗體濃度為5 IU/ml的臨界值（cut-off）測(cè)量所得敏感度為92.3%，特異性為98.6%，此濃度顯示病人為新近感染I型糖尿病。 檢測(cè)限制 分析敏感度（檢測(cè)下限為0 ± 3 SD）為0.8 IU/ml. 以4 IU/ml的濃度測(cè)量功能性敏感度的盒內(nèi)CV值為20%。 盒內(nèi)差和盒間差
用本谷氨酸脫羧酶抗體（anti-GAD）檢測(cè)試劑對(duì)健康人群進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果應(yīng)該為陰性。但是，anti-GAD可能也出現(xiàn)在外表上健康的人體內(nèi)。 在極少數(shù)神經(jīng)紊亂的患者中，約60%的Stiff-man綜合征患者的血清中有GAD65抗體。與I型糖尿病患者體內(nèi)的GAD65抗體比較，來自SMS患者體內(nèi)的GAD65抗體有很高的效價(jià)。因此來自疑似SMS患者的GAD65抗體應(yīng)該用陰性血清預(yù)稀釋1：50或1：100倍。SMS疾病患者的GAD65抗體也會(huì)出現(xiàn)的腦脊髓液中。 任何臨床確診都不應(yīng)該建立在單獨(dú)的體外診斷方法的基礎(chǔ)上。醫(yī)生應(yīng)該考慮所有的臨床的和試驗(yàn)室的檢查結(jié)果，然后才能夠確診。
請(qǐng)將所有的試劑組份恢復(fù)室溫，輕微振蕩使其混合均勻。
本試劑于體外使用。請(qǐng)仔細(xì)遵照使用說明書。 請(qǐng)注意各組分標(biāo)簽上的有效日期。同樣請(qǐng)注意重組試劑的穩(wěn)定性說明。 不要混合或使用不同批號(hào)的試劑。 不要使用來自其它廠商的試劑 加試劑時(shí)避免時(shí)間差。 不使用時(shí)，所有試劑組分都應(yīng)該在原包裝內(nèi)保存在2 - 8 °C。 在一些試劑中含有少量的 （< 0.1 % w/w） 疊氮鈉作為防腐劑。請(qǐng)不要吞咽或接觸皮膚及粘膜。 在試劑制備中所使用的來自人體血液或組織的原材料已經(jīng)被檢測(cè)，結(jié)果為HBsAg陰性，HIV陰性和HCA抗體陰性。但是，沒有試驗(yàn)?zāi)軌虮ＷC此類病毒的存在。因此請(qǐng)按照潛在的危險(xiǎn)品來處理所有試劑組分和樣本。 由于試劑包含潛在的危險(xiǎn)物質(zhì)，請(qǐng)遵守以下注意事項(xiàng)： - 當(dāng)處理試劑材料時(shí)請(qǐng)不要吸煙、吃或喝食品。 - 戴防護(hù)手套 - 不要通過嘴來吸液。 - 快速擦干溢出物，用消毒劑擦拭受污染的表面。 任何情況下，使用本試劑時(shí)都要遵守所有GLP規(guī)定以及本試劑的*規(guī)定。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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