Protein Kinase C ELISA KIT

Protein Kinase C ELISA KIT標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個標(biāo)本量收集體積＝100ul×檢測種類。

培養(yǎng)基 :"*培養(yǎng)基有售，用我們乾思生物的*培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)更省心！"

供應(yīng)商 :乾思生物

貨期 :7-10天

1.  試劑準備：所有試劑都必須在使用前達到室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。  實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

2.   加樣：加樣或加試劑時，請注意在吸取標(biāo)本 / 標(biāo)準品，酶結(jié)合物或底物時，前一個孔與后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)孵育"時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間(包括標(biāo)準品及所有樣品)好控制在10分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用多道移液器加樣。

3.   孵育：為防止樣品蒸發(fā)，試驗時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài);同時應(yīng)嚴格遵守給定的孵育時間和溫度。

4.   洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上充分拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。

5.  試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配置使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請確配置標(biāo)準品及工作液，盡量不要微量配置(如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10μl)，以避免由于不準確稀釋而造成的濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準品、檢測溶液A工作液或檢測溶液B工作液。

6.  反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化(比如，每隔10分鐘)，如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。

7.  底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。

建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準確性。

如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計算時請后乘以稀釋倍數(shù)。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

2.  自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標(biāo)準物的濃度為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準物的濃度與OD值計算出標(biāo)準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

◇      液體類標(biāo)本

標(biāo)本必須為液體，不含沉淀。包括血清、血漿、尿液、胸腹水、腦脊液、細胞培養(yǎng)上清、組織勻漿等。1ml的全血可得到0.5ml的血清或血漿。每個標(biāo)本量收集體積＝100ul×檢測種類。

◇      血清：

室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

◇      血漿：

應(yīng)根據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10％(v/v)抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

◇      尿液、胸腹水、腦脊液：

用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

◇      細胞培養(yǎng)上清：

檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

現(xiàn)在一般完整的試劑盒應(yīng)該有一下幾個組成：

（1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；

（2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；

（3）酶的底物；

（4）陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標(biāo)準品和控制血清（定量測定中）；

（5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；

（6）洗滌液，在板式ELISA中，常用的稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸緩沖鹽水；

（7）酶反應(yīng)終止液，常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的體積而異，在板式ELISA中一般采用3mol/L。

血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。血漿：應(yīng)根a據(jù)試劑盒的要求選擇EDTA、檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，加入10％(v/v)抗凝劑(0.1M檸檬酸鈉或1% heparin 或2.0%EDTA.Na2)混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。尿液、胸腹水、腦脊液：用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液。

洗板方法

1.  手工洗板方法：吸去(不可觸及板壁)或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。

2.  自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。

計算

以標(biāo)準物的濃度為縱坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，OD值為橫坐標(biāo)(對數(shù)坐標(biāo))，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準曲線查出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準物的濃度與OD值計算出標(biāo)準曲線的回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

美國菌種保藏中心， 又稱美國模式菌種收集中心(ATCC)，是位于馬里蘭洲洛克菲勒的一家私營的，非贏利性組織。目前它可以提供各種動植物細胞、標(biāo)準品、菌株達兩萬多種。
在生物制品方面，我公司是世界衛(wèi)生組織下屬生物標(biāo)準品實驗室（英國生物制品檢定所NIBSC和荷蘭VQC）、歐洲藥品質(zhì)量監(jiān)察會（EDQM）在中國的進口商，同時我部門也在代理進口一些其他菌種保藏機構(gòu)的產(chǎn)品，比如德國國家菌種保藏中心(DSMZ)、英國國立標(biāo)準菌種收藏中心(NCTC)等，為國內(nèi)科研以及生產(chǎn)用戶提供細胞株、菌株等生物標(biāo)準品。
收到后，取出培養(yǎng)瓶在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。
（一）如果細胞未長滿，用75%酒精噴灑整個瓶消毒后放到超菌臺內(nèi)，嚴格無菌操作，打開細胞培養(yǎng)瓶，吸出培養(yǎng)液，僅留下10ml培養(yǎng)液在瓶內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。
(二)如果細胞已長滿，即可進行傳代培養(yǎng)。具體步驟如下：
1. 棄去培養(yǎng)液，用PBS（不含鈣，鎂離子）洗1-2次。
2. 加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，倒轉(zhuǎn)放于37度培養(yǎng)箱1-3分鐘預(yù)熱，然后又將培養(yǎng)瓶倒轉(zhuǎn)大約30秒后，在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓分散，輕敲幾下培養(yǎng)培養(yǎng)瓶，細胞隨即脫落下來。
3. 加入6-8ml*培養(yǎng)基，吸出，分到新的培養(yǎng)瓶中。一傳二。
注意：傳代后一半用我們的培養(yǎng)基，一半用你們的，以免細胞不適應(yīng)而造成生長不好。