關(guān)鍵詞:基因甲基化檢測(cè)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)
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基因甲基化檢測(cè)技術(shù)服務(wù)|實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)——pCzn1質(zhì)粒+Arctic Express宿主菌低溫表達(dá)體系。
我們具備豐富的蛋白表達(dá)設(shè)計(jì)經(jīng)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)操作技巧，承諾客戶不成功不收費(fèi)。我們所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)真實(shí)可信，我們提供原始的表達(dá)菌株和克隆質(zhì)粒，客戶可以依據(jù)我們的實(shí)驗(yàn)報(bào)告重復(fù)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
產(chǎn)品品牌：   http://www.。。ｃｏｍ/goodsid/fenleiyi/2868603/1.html    
測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程：
DNA甲基化是zui早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，真核生物中的甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶，即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5'-端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表達(dá)，去甲基化則誘導(dǎo)了基因的重新活化和表達(dá)。這種DNA修飾方式在不改變基因序列前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。
檢測(cè)程序
1.甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變;隨后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物進(jìn)行PCR。通過(guò)電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，如果用針對(duì)處理后甲基化DNA鏈的引物能得到擴(kuò)增片段，則說(shuō)明該位點(diǎn)存在甲基化;反之，說(shuō)明被檢測(cè)的位點(diǎn)不存在甲基化。
2.亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發(fā)生甲基化的胞嘧啶被轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧啶，zui后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化稱為BSP-直接測(cè)序方法。將PCR產(chǎn)物克隆至載體后進(jìn)行測(cè)序，可以提高測(cè)序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測(cè)序法。
3.高分辨率熔解曲線法(High Resolution Melting，HRM)
在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化.
送樣要求
細(xì)胞(≥106 個(gè))、組織(≥300mg)、血液(≥1ml)、血清(≥1.5ml)等樣品材料，基因組DNA(體積≥20μl，濃度≥50 ng/μl)。
DNA甲基化的位點(diǎn)與程度的實(shí)驗(yàn)方法有三類(lèi)：
（1）（M SREs）利用對(duì)甲基化堿基敏感的限制性內(nèi)切酶。該酶不能切割甲基化的堿基位點(diǎn)，從而產(chǎn)生片段差異，電泳后，根據(jù)片段與量的差異找到甲基化位點(diǎn)與甲基化程度，
（2）另一類(lèi)是利用將沒(méi)有甲基化的C變?yōu)槠渌鼔A基或其它物質(zhì)，而甲基化的C不會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化來(lái)識(shí)別甲基化位點(diǎn)。甲基化特異的PCR (M ethylation-specific PCR,MSP)是較常用的方法。
（3）一種通過(guò)合成方法進(jìn)行序列分析的方法，它通過(guò)核苷酸和模板結(jié)合后釋放的焦磷酸引發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促使熒光素發(fā)光并進(jìn)行檢測(cè)，Pyrosequencing技術(shù)是近年一種全新的技術(shù)，這項(xiàng)技術(shù)曾經(jīng)被用作單核苷酸多態(tài)性（SNP）的基因型和單倍型的檢測(cè)，以及細(xì)菌和病毒的鑒定和分型研究。這項(xiàng)技術(shù)的一個(gè)主要特點(diǎn)是在Pyrogarm?軟件上顯示的峰值高度來(lái)自于序列分析的原始數(shù)據(jù)，通過(guò)峰值的高度可以的檢測(cè)混合DNA模板中等位基因的頻率，這種方法同樣可以用于石蠟包埋的組織，并且具有較高的重復(fù)性和性。
 MSP 實(shí)驗(yàn)流程：  
1.       基因組抽提；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以，需要實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率；
4.       引物設(shè)計(jì)（每個(gè)基因設(shè)計(jì)兩對(duì)引物，分別為：甲基化引物M，非基因化引物U，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增甲基化和非甲基化的目的片段），有時(shí)需設(shè)計(jì)巢式引物；
5.       PCR 擴(kuò)增：對(duì)甲基化和非甲基化的目的片段分別擴(kuò)增,此時(shí)盡可能使用梯度PCR儀，可以同時(shí)使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度；
6.       PCR 產(chǎn)物電泳；
7.       電泳結(jié)果分析（定性即有無(wú)甲基化，半定量即甲基化程度高低）。
BSP （亞硫酸鹽測(cè)序法）實(shí)驗(yàn)流程：  
1.       基因組抽提；
2.       基因組DNA定量；
3.       重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化（C轉(zhuǎn)化為U)，本步實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要，轉(zhuǎn)化效率高低直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，所以，需要實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不斷摸索合適的實(shí)驗(yàn)條件以確保較高的轉(zhuǎn)化效率；
4.       引物設(shè)計(jì)（每個(gè)基因設(shè)計(jì)一對(duì)引物，引物位置盡可能的避開(kāi)DNA中的CG位點(diǎn)），有時(shí)需設(shè)計(jì)巢式引物；
5.       PCR 擴(kuò)增：對(duì)實(shí)驗(yàn)樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，此時(shí)盡可能使用梯度PCR儀，可以同時(shí)使用不同的退火溫度，以篩選合適的退火溫度。
6.       PCR 產(chǎn)物電泳；
7.       對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收；
8.       回收后的PCR產(chǎn)物連接克隆載體（T載體）；
9.       轉(zhuǎn)化E.coli H5α；
10.      挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序；
11.      測(cè)序結(jié)果分析：實(shí)驗(yàn)專業(yè)甲基化分析軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行甲基化分析，可以得到如下數(shù)據(jù)：
     A. 測(cè)序序列與目的序列的相似度（%）；
     B. C-T 轉(zhuǎn)化效率（%）；
     C. 目的片段中每個(gè)CG的甲基化情況（點(diǎn)狀圖）；
     D. 每個(gè)CG的甲基化率(%)；