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更新時(shí)間:2024-08-22 18:57:13瀏覽次數(shù):3430評(píng)價(jià)
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供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 規(guī)格 | 20T |
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貨號(hào) | CA1040 | 應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,化工,生物產(chǎn)業(yè),石油 |
主要用途 | 凋亡檢測(cè)試劑 |
凋亡檢測(cè)試劑盒AnnexinV Alexa Fluor488/PI
產(chǎn)品簡介:
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面,這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸(PS)從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外,使 PS 暴露在細(xì)胞膜外表面。PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面,在細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對(duì)稱性被破壞而使 PS 暴露在細(xì)胞膜外。Annexin V 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性,對(duì) PS 有高度的親和性。因此,該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的,也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是 完好的,而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就破壞了。因此,可以采用Annexin V與PI 雙染的方法,通過流式檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡。
操作步驟:
1、細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
a)對(duì)于貼壁細(xì)胞:小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用不含 EDTA 的胰酶消化細(xì)胞,細(xì)胞可以被輕輕
用移液管或槍頭吹打下來時(shí),加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,吹打下所有的貼壁細(xì)胞,并輕輕吹散細(xì)胞。再次
收集到離心管內(nèi)。1000rpm 左右離心 5min,沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法*離心離心管底,
可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液,以避免吸走細(xì)胞。
加入約 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清;
b)對(duì)于懸浮細(xì)胞:1000rpm 左右離心 5min,沉淀細(xì)胞。對(duì)于特定的細(xì)胞,如果細(xì)胞無法*離心離心
管底,可以適當(dāng)延長離心時(shí)間或稍稍加大離心力。小心吸除上清,可以殘留約 50µl 左右的培養(yǎng)液,以避免
吸走細(xì)胞。加入約 1ml 4℃ 預(yù)冷的 PBS,重懸細(xì)胞,再次離心沉淀細(xì)胞,小心吸除上清;
2、用去離子水按 1:3 稀釋結(jié)合緩沖液(4ml 4x 結(jié)合緩沖液+12ml 去離子水);
3、用 1x 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為 1-5×106/ml;
4、取 100µl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中,加入 5µl Annexin V/Alexa Fluor 488 混勻后于室溫避光孵育 5 分鐘;
5、加入 10µl 20ug/ml 的碘化丙錠溶液(PI),并加 400µl PBS,立刻進(jìn)行流式檢測(cè)。
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):
1、空白管:陰性對(duì)照組細(xì)胞,不加 Annexin V/Alexa Fluor 488,碘化丙錠溶液(PI)。用于調(diào)節(jié)電壓;
2、單染管:陽性對(duì)照組細(xì)胞,只加 Annexin V/Alexa Fluor 488。用于調(diào)節(jié)補(bǔ)償;
3、檢測(cè)管:處理的細(xì)胞,加 Annexin V/Alexa Fluor 488,碘化丙錠溶液(PI)。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補(bǔ)償
后,獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
注意事項(xiàng):
1、Annexin V 是與磷脂酰絲氨酸(PS)親和,而 PS 在不同種屬間沒差異。在正常細(xì)胞中,PS 只分布在細(xì)胞膜脂
質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,PS 由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè);
2、低濃度胰酶消化,輕柔吹打貼壁細(xì)胞 2~3 次,離心機(jī) 4℃1000rpm 5min 離心,處理得當(dāng)?shù)脑挘让冈斐蓳p
傷可以控制在 5%以內(nèi),有對(duì)照組的情況下對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果不會(huì)造成明顯影響。
3、先加PI 不僅染色是否每組都均勻充分很難判斷,而且 PI 本身對(duì)細(xì)胞也是有毒性的,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響會(huì)比胰
酶大,不建議這樣做;
4、Annexin V 是Ca 依賴的蛋白,所以不能加入 EDTA,防止 EDTA 螯合了 Ca 離子從而影響 Annexin V,進(jìn)而影
響結(jié)果。
5、用流式檢測(cè)凋亡時(shí),PI 受時(shí)間的影響很大,因標(biāo)記了 PI 后會(huì)加大細(xì)胞毒性,隨著時(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致 PI 的染
色增加,特別是檢測(cè)早期凋亡時(shí),如果時(shí)間延長除了會(huì)導(dǎo)致在流式細(xì)胞儀上的細(xì)胞分群差距加大外,誤差會(huì)明顯
加大。一般 PI 加上后立刻上機(jī),然后在一個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)完成。兩種方法都可以,但是按照我們操作步驟造成
的誤差會(huì)更小。
相關(guān)文獻(xiàn):
《The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell》 作者:Ruifeng Zhao , Jing Jin , Xinyu Sun , Kai Jin , Man Wang , Mahmoud F. Ahmed , Qisheng Zuo , Yani Zhang ,Zhenhua Zhao , Guohong Chen , Bichun Li 期刊:Journal of cellular Biochemistry 影響因子:3.062 PMID:30076744
《Leukemia inhibitory factor promotes extracellular matrix synthesis in degenerative nucleus pulposus cells via MAPK-ERK1/2 signaling pathway》 作者:Hao Zhou,Jieliang Shen,Zhenming Hua,Xiaoming Zhong 期刊:Biochemical and Biophysical Research Communications 影響因子:2.705 PMID:30446227
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