大多數(shù)感染真核生物的病毒都有一個(gè)正單鏈RNA(+ssRNA)基因組。一般認(rèn)為，+ssRNA病毒只在基因組正鏈RNA(+RNA)中編碼開(kāi)放閱讀框架(ORF)，而病毒的負(fù)義鏈RNA(-RNA)是一種病毒復(fù)制中間體，其功能是作為后代基因組RNA生物合成的模板。病毒基因組RNA作為mRNA直接與核糖體相互作用，并被翻譯成病毒蛋白質(zhì)，包括用于病毒復(fù)制的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRPs)。
植物病毒具有密集的基因組，小開(kāi)放閱讀框(sORFs)是編碼長(zhǎng)度小于100個(gè)氨基酸(aa)蛋白質(zhì)的開(kāi)放閱讀框；sORFs翻譯的小蛋白與不同生物體（包括植物和動(dòng)物病毒）的各種生物過(guò)程有關(guān)。馬鈴薯Y病毒科目前由12個(gè)屬、237個(gè)物種組成，其中包括最大的植物感染+ssRNA病毒（馬鈴薯Y病毒）。約10kb的馬鈴薯病毒基因組由編碼大的多聚蛋白的單個(gè)ORF組成，該蛋白被蛋白水解加工成10種功能蛋白，分別為P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、VPg、NIa-Pro、NIb和衣殼蛋白質(zhì)(CP)。另一種蛋白質(zhì)P3N-PIPO是通過(guò)轉(zhuǎn)錄滑移合成的，這導(dǎo)致在一小部分RNA轉(zhuǎn)錄物的5’端附近增加了額外的A殘基。但馬鈴薯Y病毒屬是否在其RNA中編碼額外的小蛋白尚未被探索。
冠狀病毒（冠狀病毒科）是一個(gè)有包膜+ssRNA病毒的大家族。嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)屬于冠狀病毒科β冠狀病毒屬。SARS-CoV-2的基因組大小約為30kb，包含14個(gè)典型的病毒開(kāi)放閱讀框，50個(gè)ORF1a/ORF1ab組成了整個(gè)基因組的前三分之二，它編碼一種多聚蛋白，最終被蛋白酶切割成16種非結(jié)構(gòu)蛋白(Nsp1-Nsp16)，病毒基因組3’端的最后三分之一包含13個(gè)ORF，編碼4種結(jié)構(gòu)蛋白（刺狀蛋白[S]、包膜蛋白[E]、膜蛋白[M]和核衣殼蛋白[N]）和9種可能的輔助蛋白(ORF3a、ORF3b、ORF6、ORF7a、ORF7b、ORF8、ORF9b、ORF9c和ORF10)。但SARS-CoV-2的RNA中是否編碼額外的小蛋白仍不清楚。
本文在來(lái)自不同科的幾種植物、脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物+ssRNA病毒的RNA中鑒定了幾個(gè)潛在的小反向ORFs(rORFs)。通過(guò)研究蕪菁花葉病毒(TuMV)，發(fā)現(xiàn)這些sORFs對(duì)病毒侵染至關(guān)重要，其編碼的蛋白質(zhì)具有特定的亞細(xì)胞定位，證明了rORF2蛋白是由馬鈴薯Y病毒rORFs編碼的蛋白，可與病毒復(fù)制復(fù)合體共定位以及TuMV RdRP相互作用，并作為毒力因子發(fā)揮作用。動(dòng)物病毒SARS-CoV-2的rORFs(rORF1-rORF3)可能通過(guò)拮抗I型干擾素(IFN-I)介導(dǎo)的抗病毒先天免疫反應(yīng)來(lái)促進(jìn)水泡性口炎病毒(VSV)感染。另外，RNA中的TuMV-rORF可能是由病毒內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)翻譯的。因此，作者提出+ssRNA病毒在其-RNA中編碼小功能蛋白，這些蛋白可以影響病毒復(fù)制和毒力，或者可能有助于逃避宿主先天免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病毒侵染。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了對(duì)+ssRNA病毒所采用的編碼策略的理解，并擴(kuò)大了已知的病毒蛋白質(zhì)組及其與宿主細(xì)胞的潛在相互作用。
基本信息
題目：
Plant and Animal Positive-sense Single-stranded RNA Viruses Encode Small Proteins Important for Viral Infection in Their Negative-sense Strand
期刊：Molecular Plant
影響因子：27.5
PMID: 37777826
DOI: 10.1016/j.molp.2023.09.020
通訊作者：周雪平 李方方
作者單位：
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
索萊寶合作產(chǎn)品：
產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 |
K200015M | Anti-mCherry Tag Monoclonal Antibody |
摘 要
正單鏈RNA(+ssRNA)病毒是自然界中含量豐富的真核生物病毒，需要使用基因組+RNA作為復(fù)制模板合成-RNA。植物和動(dòng)物+ssRNA病毒的RNA中含有小的開(kāi)放閱讀框(ORF)（反向ORF[rORF]）。利用蕪菁花葉病毒(Tumv)作為植物+ssRNA病毒的模型，證明了rORFs編碼的小蛋白具有特定的亞細(xì)胞定位，并通過(guò)質(zhì)譜分析證實(shí)rORF2在感染細(xì)胞中的存在。TuMV rORF2編碼的蛋白質(zhì)形成點(diǎn)狀顆粒，定位于核周區(qū)域，并與病毒復(fù)制復(fù)合體共定位。RORF2蛋白可以直接與病毒RNA依賴的RNA聚合酶相互作用，rORF2的突變消除了病毒的侵染，而rORF2的異位表達(dá)拯救了突變的病毒。此外，SARS-CoV-2的RNA具有抑制I型干擾素產(chǎn)生和促進(jìn)水泡性口炎病毒侵染的作用。作者提供了TuMV可能利用內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)來(lái)翻譯這些小rORF的證據(jù)。綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)表明+ssRNA病毒的-RNA也可以具有編碼能力，其中編碼的小蛋白在病毒侵染中發(fā)揮關(guān)鍵作用。
研究?jī)?nèi)容及結(jié)果
1.鑒定+ssRNA病毒RNA中的sORFs
馬鈴薯Y病毒科、南方菜豆花葉病毒科、冠狀病毒科和黃病毒科病毒的基因組序列分析發(fā)現(xiàn)了許多編碼超過(guò)10個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)的ORFs，與+RNA中已知的ORFs類似，這些病毒的RNA在每個(gè)科內(nèi)選定的病毒子集中具有高度代表性（圖1A–D）。由于這些ORFs是在病毒+RNA的反向互補(bǔ)序列中預(yù)測(cè)的，所以將它們命名為rORFs（圖1E）。
圖 1
2.TuMVrORF編碼的蛋白質(zhì)具有特定的亞細(xì)胞定位，可被招募到病毒復(fù)制復(fù)合體(VRC)
在TuMV中鑒定出幾個(gè)小rORFs、rORF1-rORF4，并發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯Y病毒科中有大量匹配（圖1A和2A）。TuMV-rORF1–rORF3編碼的蛋白質(zhì)與黃色熒光蛋白(YFP)融合，定位于細(xì)胞核、核周區(qū)域和細(xì)胞質(zhì)，而rORF4僅限于核周區(qū)域（圖2B）。TuMV rORF1-YFP定位在葉綠體周圍，并與過(guò)氧化物酶體標(biāo)記DsRed-SKL共定位，但不與高爾基體標(biāo)記共定位（圖2C），與葉綠素自發(fā)熒光和ER標(biāo)記mCherry-HDEL（his-asp-glu-leu在其N末端融合mCherry蛋白）的共定位發(fā)現(xiàn)TuMVrORF3-YFP在葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中（圖2D）。馬鈴薯Y病毒科復(fù)制發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合的VRC中，在細(xì)胞核附近可以看到密集的塊狀物。使用表達(dá)青色熒光蛋白(CFP)標(biāo)記的病毒RdRP(NIb)和mCherry標(biāo)記的葉綠體定位膜蛋白(6K2)的TuMV-6K2-mCherry-CFP-NIb感染性克?。▓D2E），可以發(fā)現(xiàn)這些rORF編碼的蛋白質(zhì)在病毒侵染過(guò)程中被招募到VRC中復(fù)制（圖2F）。四種新蛋白均與6K2誘導(dǎo)的TuMVVRC和dsRNA共定位，這些rORF在病毒復(fù)制過(guò)程中VRC的形成和活性中具有潛在作用（圖2G-H）。
圖 2
3.TuMV rORF2編碼蛋白是病毒感染所需的毒性因子
所有突變病毒在接種后60h時(shí)均呈現(xiàn)出明顯較少的RNA和蛋白質(zhì)積累（圖3A-C）。接種后5d和12d，TuMV-GFP-mrORF2未能在接種植物的全身組織中檢測(cè)到病毒RNA和CP；rORF1、rORF3或rORF4的突變對(duì)TuMV癥狀和病毒積累的影響較輕微（圖3D-H）。
除P3NPIPO外，rORF2蛋白與已報(bào)道的TuMV蛋白同時(shí)被檢測(cè)到（圖4A-B）。PVX-rORF2在28d時(shí)表現(xiàn)出嚴(yán)重的癥狀（圖4C）。此外，PVX載體表達(dá)的rORF2基因可以彌補(bǔ)接種TuMV-GFPmrORF2突變體的本氏煙草中rORF2的缺失（圖4D-F）。RORF2-YFP的轉(zhuǎn)基因表達(dá)恢復(fù)了TuMV-mrORF2-GFP的感染（圖4G-I）。
rORF2和11種典型TuMV蛋白酵母雙雜交(Y2H)測(cè)定發(fā)現(xiàn)rORF2編碼的蛋白質(zhì)與酵母細(xì)胞中的NIb相互作用（圖4J）。紅色熒光蛋白(RFP)-H2B轉(zhuǎn)基因本氏煙草植物葉子的雙分子熒光互補(bǔ)(BiFC)，證實(shí)體內(nèi)相互作用發(fā)生在植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中（圖4K）。NIb與TuMV感染細(xì)胞VRC中的rORF2相互作用（圖2F和4K），進(jìn)一步表明rORF2參與TuMV復(fù)制。
圖 3
圖 4
4.SARS-CoV-2rORF的特征
使用SARS-CoV-2作為模型（圖5A）推測(cè)由rORFs編碼的蛋白質(zhì)尺寸較小(<10kDa)，rORFs在SARS-CoV-2相關(guān)變體(VOC)中也保守（圖5B）。rORF3編碼的蛋白質(zhì)預(yù)計(jì)包含兩個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域（圖5C）。SARS-CoV-2 rORF編碼蛋白的GFP標(biāo)記，三種融合GFP的rORF編碼蛋白均積累到相當(dāng)?shù)乃?，但在HEK293T細(xì)胞中出現(xiàn)不同的亞細(xì)胞定位。GFP-rORF1分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，GFP-rORF2主要位于細(xì)胞核中，GFPrORF3主要分布在細(xì)胞質(zhì)中（圖5D-E）。
圖 5
5.SARS-CoV-2rORF編碼蛋白是IFN-I拮抗劑
標(biāo)記SARS-CoV-2的rORF1-3可以降低維甲酸誘導(dǎo)基因IRIG-IN誘導(dǎo)的干擾素β啟動(dòng)子活性（圖6A）。SARS-CoV-2 rORF2和ORF6可明顯抑制外源干擾素-α誘導(dǎo)的ISRE啟動(dòng)子的活性（圖6B）。
圖 6
6.SARS-CoV-2rORF編碼蛋白抑制SG的形成并促進(jìn)病毒侵染
與表達(dá)GFP的細(xì)胞相比，表達(dá)N-FLAG的細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞可檢測(cè)的SG面積顯著減少，并且N蛋白與SG中的G3BP1共定位，表達(dá)rORF1-GFP和rORF3-GFP的細(xì)胞中SG形成顯著減少（圖6C和6D），表明rORF1和rORF3介導(dǎo)對(duì)SG形成的抑制。GFP-rORF1和G3BP1也共定位于NaAsO2處理細(xì)胞中的剩余SG（圖6C），表明rORF1可能通過(guò)與G3BP1相互作用隔離G3BP1來(lái)減弱SG形成。表達(dá)單個(gè)SARS-CoV-2rORF的細(xì)胞中VSV-GFP侵染的效率顯著高于對(duì)照細(xì)胞（圖6E-F）。
7.小TuMV rORF可能由病毒IRES翻譯
作者設(shè)計(jì)了一個(gè)雙順?lè)醋酉到y(tǒng)（圖7A）。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有TuMV rORFs上游序列的雙順?lè)醋虞d體瞬時(shí)地表達(dá)到本氏煙草的葉片組織中（圖7B）。mCherry積累的差異不是由于mRNA水平的變化所致（圖7C）。用β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的序列取代驅(qū)動(dòng)GFP-mCherry轉(zhuǎn)錄的35S啟動(dòng)子（圖7D）。蛋白質(zhì)印跡分析表明無(wú)啟動(dòng)子載體無(wú)法在本氏煙草葉子中表達(dá)GFP或mCherry（圖7E）。qRT-PCR分析表明35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)mRNA產(chǎn)物在植物細(xì)胞中具有特異性條帶，表明不存在隱性剪接位點(diǎn)（圖7F）。
圖 7
結(jié) 論
使用兩種不相關(guān)的+ssRNA病毒感染不同來(lái)源的生物體，實(shí)驗(yàn)證明了+ssRNA病毒的RNA在病毒侵染過(guò)程中編碼具有生物學(xué)作用的小蛋白。該研究需重新考慮之前的假設(shè)，即該鏈缺乏生物相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼信息，如植物TuMV所示，需要重新研究已知的+ssRNA-vi病毒的蛋白質(zhì)組，并且可能會(huì)擴(kuò)大。
索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)
索萊寶產(chǎn)品亮點(diǎn)
產(chǎn)品貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 |
P08119 | Recombinant mCherry Tag protein |
VT001104 | pBV220-mCherry |
VT000009 | pET28a-mCherry |
K200047M | Anti-GFP Tag Monoclonal Antibody |
K009323P | Anti-GFP-Tag Polyclonal Antibody |
K009757P | Anti-EGFP Polyclonal Antibody |
K106580P | Anti-EGFP Polyclonal Antibody |
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