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丙酮酸激酶(PK)活性檢測(cè)試劑盒

操作步驟：

一、樣本的前處理

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4個(gè)）提取液體積（mL）為 500-1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或者 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為 1:5-10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟及加樣表：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng) 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 樣本測(cè)定

（1） 在試劑二瓶中加入 17ml 試劑一和 1ml 蒸餾水充分溶解，置于 37℃（哺乳動(dòng)物）或 25℃ （其他物種）水浴 5 分鐘，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（2） 在試劑三中加入 1ml 蒸餾水充分溶解，冰上放置備用，現(xiàn)配現(xiàn)用。

（3） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 樣本、10μL 試劑三和 180μL 試劑二，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時(shí)的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2，計(jì)算△A=A1-A2.

丙酮酸激酶(PK)活性檢測(cè)試劑盒

PK 活性計(jì)算： A．用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、 血清（漿）PK 活力的計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/mL）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷V 樣÷T=1608×△A

2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PK 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/mg prot）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=1608×△A ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/g 鮮重）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=1608×△A ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=3.216×△A V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：比色皿光徑， 1 cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

B．用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下：

1、 血清（漿）PK 活力的計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每毫升血清（漿）每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/mL）=[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷V 樣÷T=3216×△A 2、 組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 PK 活力的計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：?jiǎn)挝坏亩x：每 mg 組織蛋白每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/mg prot）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(Cpr×V 樣)÷T=3216×△A ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算單位的定義：每 g 組織每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/g 鮮重）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T=3216×△A ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗 1nmolNADH 定義為一個(gè)酶活力單位。 PK（U/10 4 cell）＝[△A×V 反總÷（ε×d）×10 9] ÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=6.432×△A V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 -4L；ε：NADPH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2min； Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬(wàn)。

丙酮酸激酶(PK)活性檢測(cè)試劑盒

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；試劑一：液體 20 mL×1 瓶，4℃保存；試劑二：粉劑×1 支，-20℃保存；試劑三：液體×1 支，4℃保存；