主要用途

細(xì)菌甲羥戊酸激酶（mevalonate kinase）活性酶連續(xù)循環(huán)光譜法定量檢測試劑是一種旨在通過底物甲羥戊酸受到甲羥戊酸激酶磷酸化后，進(jìn)而由丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續(xù)循環(huán)法反應(yīng)系統(tǒng)，測定產(chǎn)生ADP過程中，伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反應(yīng)， 即采用光譜法測定其氧化后峰值（NADH濃度）的變化，以分析樣品中甲羥戊酸激酶活性的經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)菌，尤其是革蘭氏陽性菌樣品的甲羥戊酸激酶活性檢測。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡捷，性能穩(wěn)定，高度敏感。

保存方式

保存在－20℃冰箱里，避免反復(fù)凍融；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品處理的容器

比色皿或96孔板：用于光譜分析操作的容器

（微型）臺式離心機(jī)：用于樣品預(yù)處理

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于樣品光譜分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 待測樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好10毫升待測的細(xì)菌放進(jìn)37℃搖床孵育16小時(shí)，速度為220RPM

2． 直至OD600＝0.4至0.8，即1至2 X 10⁷細(xì)胞/毫升

3． 置于冰槽里5分鐘

4． 放進(jìn)4℃臺式離心機(jī)離心5分鐘，速度為1000g

5． 小心抽去上清液

6． 加入xx微升裂解液（Reagent A），充分混勻

7． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

8． 加入xx微升活性液（Reagent B）

9． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

10． 置于冰槽里15分鐘，期間每隔5分鐘強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

11． 放進(jìn)4℃微型臺式離心機(jī)離心15分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

12． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

13． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測（注意：建議使用 BCA蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30031.1）

14． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操 

二、 測定準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好待測樣品（例如細(xì)菌裂解懸液等），置于冰槽里 

2． 設(shè)定好分光光度儀（溫度為30℃）：波長為340nm，間隔2分鐘，讀數(shù)6次（共10分鐘），并置零

3． 緩沖液（Reagent C）室溫下均衡溫度

三、 背景對照測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入xx微升陰性液（Reagent G）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對照：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘

四、 樣品測定

1． 移取xx微升緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）

3． 加入xx微升反應(yīng)液（Reagent E）

4． 加入xx微升底物液（Reagent F）

5． 放進(jìn)30℃培養(yǎng)箱里靜置3分鐘

6． 加入10微升待測樣品（注意：50微克細(xì)菌裂解蛋白；樣品須溶解）

7． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

8． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品活性讀數(shù)：340波長讀數(shù)0分鐘 －340波長讀數(shù)10分鐘

五、 計(jì)算樣品活性

六、 酶標(biāo)儀測定

1． 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對照和樣品

2． 分別移取xx微升緩沖液（Reagent C）到96孔板里

3． 分別加入xx微升酶促液（Reagent D）

4． 分別加入x微升反應(yīng)液（Reagent E）

5． 分別加入xx微升底物液（Reagent F）

6． 輕輕搖動(dòng)96孔板

7． 在30℃溫度下孵育3分鐘

8． 分別加入xx微升陰性液（Reagent G）或待測樣品（50微克細(xì)菌裂解懸液蛋白）到相應(yīng)孔里（注意：樣品須清澈）

9． 輕輕搖動(dòng)96孔板

10． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測：0分鐘讀數(shù)和10分鐘讀數(shù)

11． 活性計(jì)算：