Kary Mullis博士也許并沒(méi)有想到，他發(fā)明的PCR技術(shù)能夠在未來(lái)三十年保持長(zhǎng)盛不衰。這不僅要?dú)w功于DNA聚合酶的發(fā)展，也要?dú)w功于PCR儀的不斷升級(jí)。如今，反應(yīng)效率提高，反應(yīng)體積減少，使得PCR逐漸應(yīng)用在更廣泛的領(lǐng)域。選購(gòu)PCR儀，似乎并不是一件難事。然而，對(duì)于一些關(guān)鍵的參數(shù)，你真的了解它們的意義嗎?
快速變溫
現(xiàn)在，快速PCR已成為一種潮流。反應(yīng)時(shí)間從90分鐘縮短到30分鐘，是受歡迎的，畢竟誰(shuí)也不想在預(yù)約PCR儀時(shí)排隊(duì)等太久。溫度循環(huán)是所有PCR的基礎(chǔ)。儀器的變溫速率將決定PCR運(yùn)行的整體速度。毫無(wú)疑問(wèn)，變溫越快，PCR運(yùn)行也越快。宣傳資料往往也會(huì)首先展示zui高變溫速率以暗示PCR儀運(yùn)行速度更快。因此，在拿到參數(shù)表時(shí)，我們*時(shí)間會(huì)留意變溫速率，也就是升降溫速率。
不過(guò)，如果大家留心看，通常會(huì)發(fā)現(xiàn)ramp rate前面還會(huì)有一個(gè)Max，這說(shuō)明制造商公布的是zui大變溫速率。zui大模塊變溫速率(maximum block ramp rate)表示模塊變溫速率的極限峰值。在PCR運(yùn)行過(guò)程中，上述zui大性能只在極短的時(shí)間內(nèi)可達(dá)到，那種掐著秒表來(lái)計(jì)算變溫速率的方法是不可取的。因此有誠(chéng)意的制造商還會(huì)公布平均模塊變溫速率(average block ramp rate)，表示在較長(zhǎng)的變溫范圍內(nèi)溫度變化的速率。這個(gè)參數(shù)沒(méi)那么炫目，但更具參考意義，具有比較價(jià)值。
當(dāng)然，樣品的變溫速率可沒(méi)有模塊那么高。這就好比在爐子上燒水，爐子很快就達(dá)到100oC以上，但水可能只有50oC。模塊的熱量傳遞到樣品還需要一定的滯后時(shí)間。因此，只根據(jù)模塊溫度編程而不考慮樣品體積的變溫速率并不能算準(zhǔn)確。Applied Biosystems在這一點(diǎn)上就很周道，提供了另一種參數(shù)，平均樣本變溫速率(average sample ramp rate)或者zui大樣品變溫速率(maximum sample ramp rate)。這個(gè)參數(shù)能反應(yīng)儀器根據(jù)體積來(lái)控制樣品達(dá)到設(shè)置溫度、遵循預(yù)設(shè)的實(shí)驗(yàn)方案運(yùn)行的真實(shí)能力，更有效地評(píng)估PCR儀的真實(shí)性能。
以Applied Biosystems ProFlex? PCR系統(tǒng)為例，96孔和全新3x32孔模塊的zui大變溫速率達(dá)到6.0oC/秒，而標(biāo)示樣品的zui大變溫速率也達(dá)到4.4oC/秒(1 μl樣品體積)。配合快速PCR試劑，擴(kuò)增500 bp的片段，不到半小時(shí)即可完成。它采用溫度控制算法將樣本體積及反應(yīng)管的厚度考慮在內(nèi)，其實(shí)際模塊溫度高于設(shè)置點(diǎn)，從而使滯后的樣本溫度能夠更快地達(dá)到設(shè)置點(diǎn)(又稱(chēng)為模塊熱過(guò)沖)。算法要才可根據(jù)不同體積使樣本達(dá)到穩(wěn)定的設(shè)置點(diǎn)溫度且無(wú)過(guò)沖及相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)。
溫控準(zhǔn)確
對(duì)于PCR反應(yīng)而言，zui重要的莫過(guò)于溫度控制的準(zhǔn)確性。由于PCR是一個(gè)幾何級(jí)數(shù)擴(kuò)增的過(guò)程，不論是變性、退火還是延伸都需要準(zhǔn)確控制溫度，對(duì)退火而言溫控顯得尤為重要。有時(shí)，退火溫度相差1oC，就能帶來(lái)迥然不同的結(jié)果。目前，市場(chǎng)上的大多數(shù)PCR儀采用Peliter元件加熱，溫度準(zhǔn)確性在±0.2oC左右。
溫度控制算法的性無(wú)疑會(huì)影響溫度控制的。前面提到的模塊熱過(guò)沖，需要非常豐富的經(jīng)驗(yàn)，的算法才可使不同體積的樣本達(dá)到穩(wěn)定的設(shè)置點(diǎn)溫度且無(wú)過(guò)沖及相關(guān)的負(fù)面效應(yīng)。
對(duì)于96孔板PCR儀來(lái)說(shuō)，另一個(gè)重要的參數(shù)是溫度均一性，這指的是各孔之間的溫度差異。均勻擴(kuò)增反應(yīng)板各孔的能力至關(guān)重要，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)常常被忽略。如果孔間的溫度條件不一致，那么我們自然無(wú)法通過(guò)比較兩個(gè)不同位置的反應(yīng)孔數(shù)據(jù)，而得到可靠的結(jié)論。大多數(shù)儀器的溫度均一性在±0.3到±0.5oC之間。比如，Eppendorf的Mastercycler Pro S，在20-72oC時(shí)，均一性≤ ±0.3oC，在95oC，均一性≤ ±0.4oC。
對(duì)于梯度PCR而言，溫度準(zhǔn)確性的要求似乎更高。梯度PCR儀zui先由Eppendorf公司在1998年研發(fā)成功推向市場(chǎng)(Mastercycler Gradient)。通過(guò)設(shè)置一系列的梯度退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增，從而一次反應(yīng)就可以篩選出的退火溫度，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，在節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間。
傳統(tǒng)的梯度PCR儀的加熱模塊由分別控溫的2個(gè)Peltier元件組成，對(duì)它們?cè)O(shè)置不同的溫度，通過(guò)熱傳導(dǎo)可形成溫度梯度。不過(guò)，由于均勻的金屬加熱模塊兩端設(shè)置的高溫和低溫之間的熱學(xué)相互作用，無(wú)法實(shí)現(xiàn)真正的線性梯度。實(shí)際上，均勻的金屬加熱模塊上的溫度更多呈S形曲線而非線性梯度，列間的溫度差異不一致使其難以確定優(yōu)化后的真實(shí)退火溫度，尤其是在優(yōu)化難以處理的試驗(yàn)時(shí)。
Applied Biosystems在這方面就有獨(dú)到的設(shè)計(jì)，它的VeriFlex加熱模塊有zui多有6個(gè)獨(dú)立的加熱/冷卻模塊，由溫度控制器單獨(dú)控制。各個(gè)Peltier模塊之間用隔熱材料進(jìn)行物理隔離，使得相鄰的Peltier模塊間的溫度干擾zui小化，溫度控制更加。VeriFlex技術(shù)可以在金屬加熱模塊上模擬真正的線性溫度斜率。而且梯度模式和普通模式下升降溫的速率一致，確保優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件在隨后的日常運(yùn)行中也表現(xiàn)出一致的結(jié)果。
研究人員的另一個(gè)噩夢(mèng)是PCR反應(yīng)會(huì)蒸發(fā)。這種蒸發(fā)現(xiàn)象使PCR反應(yīng)體系中各組分濃度升高，特別是引物濃度升高，直接導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。Eppendorf Mastercycler pro 梯度PCR儀則采用vapo.protect技術(shù)，防止PCR反應(yīng)體系的蒸發(fā)。vapo.protect 熱蓋利用一塊軟墊覆蓋PCR耗材，各種不同形狀的PCR耗材都能實(shí)現(xiàn)覆蓋。這種技術(shù)提高了結(jié)果的重復(fù)性，是小體積擴(kuò)增的理想之選。Applied Biosystems則是通過(guò)熱蓋的自動(dòng)調(diào)節(jié)和凹形設(shè)計(jì)確保PCR管的密封，基本上市場(chǎng)面上常見(jiàn)的PCR耗材都可以使用。當(dāng)然，通常廠家會(huì)建議使用Applied Biosystems自己的PCR耗材，畢竟是經(jīng)過(guò)廠家多重測(cè)試的，肯定也不會(huì)錯(cuò)。
靈活更換
雖說(shuō)PCR儀已逐漸設(shè)計(jì)成個(gè)人化的儀器，但真的是實(shí)驗(yàn)室中人手一臺(tái)，顯然并不太實(shí)際。實(shí)驗(yàn)室中通常有多個(gè)課題，每個(gè)人的應(yīng)用也各不相同，因此PCR儀能滿足不同的需求。96孔模塊是大多數(shù)人的選擇，但未來(lái)有什么樣的需求，當(dāng)下并不清楚。抱著開(kāi)放的心態(tài)，選擇一臺(tái)靈活的PCR儀，也許是明智的。
許多PCR儀都允許更換樣品模塊，包括96孔、雙48孔和384孔等。對(duì)于有些儀器，各個(gè)模塊之間是獨(dú)立的，就像多臺(tái)PCR儀一樣，可設(shè)置不同的運(yùn)行程序。比如，Applied Biosystems的ProFlex PCR系統(tǒng)就提供3 x 32孔獨(dú)立模塊，允許同時(shí)運(yùn)行3組實(shí)驗(yàn)，每組*獨(dú)立，互不干擾。這種設(shè)計(jì)提高了效率，讓苦苦等待成為過(guò)去。另外，除了標(biāo)準(zhǔn)的96孔模塊，它還提供雙96孔和雙384孔模塊，滿足高通量的測(cè)序需要。此外還有雙槽式模塊可供選擇，支持QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)使用的芯片
Bio-Rad的C1000 Touch PCR儀也提供4個(gè)可互換的模塊，包括96孔、96深孔、48孔和384孔。96深孔模塊可容納0.2或0.5 ml PCR反應(yīng)管，使反應(yīng)體積zui高可達(dá)125 μl。這種大的反應(yīng)體積適合新一代測(cè)序或芯片的樣品制備。
美好體驗(yàn)
性能要，操作可得簡(jiǎn)單，這也是PCR儀選購(gòu)時(shí)一個(gè)重要的考慮因素。畢竟，實(shí)驗(yàn)室里用戶的水平參差不齊，既有經(jīng)驗(yàn)豐富的老手，也有剛剛?cè)腴T(mén)的新手。操作直觀、輕松編程，相信是每個(gè)人的愿望。
幸運(yùn)的是，如今的制造商在設(shè)計(jì)時(shí)都考慮到這一點(diǎn)，紛紛采用碩大的觸摸屏。有些人可能還不太習(xí)慣，但大多數(shù)人享受著這種隨便點(diǎn)點(diǎn)就能設(shè)置好程序的過(guò)程。之前，Veriti PCR儀作為市場(chǎng)上*款觸摸屏PCR儀，在推出時(shí)就受到很多客戶的歡迎。斯坦福大學(xué)的博士后Hugo Hilton曾表示：“觸摸屏顯示很直觀，讓用戶對(duì)反應(yīng)過(guò)程一目了然。"隨后Bio-Rad也相繼推出了C1000和T100觸摸型PCR儀。隨著觸摸屏技術(shù)的快速發(fā)展，越來(lái)越靈敏、能快速反應(yīng)的PCR儀也隨之產(chǎn)生，比如Applied Biosystems的ProFlex和SimpliAmp，那感覺(jué)和iPad是一樣一樣的。
遠(yuǎn)程訪問(wèn)也增強(qiáng)了用戶體驗(yàn)，它讓用戶能夠通過(guò)智能手機(jī)或平板電腦，調(diào)整操作并查看初步結(jié)果。在使用ProFlex PCR系統(tǒng)時(shí)，你就能通過(guò)免費(fèi)的My ProFlex手機(jī)客戶端，從你的辦公室、會(huì)議室、家里，甚至其他任何地方進(jìn)行遠(yuǎn)程連接，查看PCR實(shí)驗(yàn)的運(yùn)行情況，或查看哪個(gè)模塊可以使用。
隨著PCR的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，人們也希望將PCR儀帶出實(shí)驗(yàn)室，帶到診所和田間。一些制造商也推出了便攜的PCR儀，如Ahram Biosystems。不過(guò)，在大多數(shù)情況下，儀器還是擺在擁擠的實(shí)驗(yàn)臺(tái)上。而且，一些必要的組件是不可少的，比如加熱元件、電源等。因此，高性能的PCR儀還是占有一定的體積。不過(guò)，如今連測(cè)序儀都跟U盤(pán)一般大了，還有什么是不可能的呢。
過(guò)去三十年，PCR已經(jīng)帶給了我們很多的驚喜。未來(lái)，儀器性能會(huì)更高，操作會(huì)更簡(jiǎn)便，功能會(huì)更多樣，只是，選擇會(huì)更困難。擦亮雙眼，看看你真的需要什么，再做決定吧。
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