雙歧桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒

Bifidobacterium spp.

產(chǎn)品及特點

雙歧桿菌（Bifidobacterium）是一類存在于人體中非常重要的專性厭氧菌，于 1899 年首先在母乳喂養(yǎng)的健康嬰兒糞便中發(fā)現(xiàn)并分離，研究證實雙歧桿菌具有平衡腸 道菌群、降膽固醇、延緩衰老及抗腫瘤等生理功能，是人體益生菌群的主要組成。添加 雙歧桿菌的微生態(tài)制劑開發(fā)研究已成為一大熱點，廣泛應用于食品、保健和醫(yī)療等領域。 但不斷有報道指出國內(nèi)外市場上雙歧桿菌微生態(tài)制劑標示名稱混亂，很多國家市場上雙 歧桿菌制品假冒代替現(xiàn)象嚴重。針對該現(xiàn)象，開發(fā)了針對雙歧桿菌特異性檢測試劑盒， 本產(chǎn)品利用實時熒光定量 PCR 技術，通過熒光染料實時顯示樣品雙歧桿菌模板 DNA 的量, 并通過坐標曲線表示出來, 結果直觀準確。它具有下列特點： 

1. 根據(jù)雙歧桿菌屬 tuf 基因，設計的針對雙歧桿菌的 PCR 引物，克服了其他細菌的 干擾。

2. 即開即用，用戶只需要提供樣品模板，操作簡單，定量準確快速。

3. 熒光定量 PCR 檢測，反應特異性強。

4. 本試劑盒可以進行 100 次 20uL 體系的 qPCR 反應。

5. 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

雙歧桿菌屬通用染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存(B 袋的陽性對照一定要放擴增區(qū)，A 袋的試劑放樣品準備區(qū))，有 效期一年。 

自備試劑 樣品 DNA。

使用方法 一、樣品 DNA 的制備

1. 用自選方法純化雙歧桿菌樣品的 DNA，

二、引物的制備（在樣品制備室進行）

2. 按引物標簽提示在裝引物干粉的管中直接加入適量的超純水（加入量見引物試管上 的標簽），使得兩條引物的濃度均為 10 uM（10pmol/uL）。

三、稀釋陽性對照（以 10E3-10E7 這 5 個 10 倍稀釋度為例。由于標準品濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成 分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體菌做陽性對照，只 提供可以直接使用的長為 339bp 的 DNA 段作為陽性對照。

3. 標記 5 個離心管，分別為 7，6，5，4，3 號。

4. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 超純水（用帶芯槍頭，下同）。

5. 先將本試劑盒提供的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照用超純水 10 倍梯度稀釋到 10E8 拷貝/μL。放冰上待用。

6. 在 7 號管中加入 5 μL 10E8 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上步稀釋所 得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用

 7. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 10E7 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

8. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 10E6 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

9. 換槍頭，在 4 號管中加入 5 μL 10E5 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E4 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

10. 換槍頭，在 3 號管中加入 5 μL 10E4 拷貝/μL 的雙歧桿菌 Tuf 基因陽性對照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 10E3 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用

三、設置 PCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

11. 在 PCR 管中加入下列成分（待測樣品需要做三次重復，下表只列出一次。樣品管 和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有成分蓋上蓋子 儲存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。 

13. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結合 DNA 時， 大吸收光譜在 471 nm，結合 DNA 時的大吸收光譜在 500 nm，大發(fā)射光 譜在 530 nm。

四、數(shù)據(jù)處理

14. 以 Tuf 基因序列陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。 再以待測樣品濃度的 log 為橫軸，以 Ct 值為縱軸，通過待測樣品的 Ct 值計算出樣 品 DNA 的濃度。