羊邊界病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Border Disease Virus(BDV)

產(chǎn)品及特點(diǎn)

羊邊界病病毒(Border Disease Virus，BDV)會(huì)引起羊邊界病，是新生羔羊以身體多毛、生長(zhǎng)不良和神經(jīng)異常為主要特征的一種先天性傳染病。邊界病病毒的臨診表現(xiàn)主要取決于宿主的年齡。臨診疾病限于在懷孕期受到感染的新生或年幼羔羊。如一個(gè)羊群受到感染時(shí)，主要表現(xiàn)在繁殖季節(jié)不孕或流產(chǎn)增多，流產(chǎn)可發(fā)生于懷孕的任何時(shí)期，但以懷孕后90天左右為多。由于胎兒的嚴(yán)重畸型導(dǎo)致脊柱后側(cè)凸或關(guān)節(jié)變曲而表現(xiàn)為難產(chǎn)。邊界病病毒呈世界性分布，大多數(shù)飼養(yǎng)綿羊國家都有本病的報(bào)道，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。它具有下列特點(diǎn)：

1.一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2.根據(jù)羊邊界病病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測(cè)，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研，不能用于臨床。

羊邊界病病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。陽性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供DNA段作為陽性對(duì)照。

自備試劑 樣品RNA

使用方法 一、稀釋陽性對(duì)照（以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
2.在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
3.換槍頭，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品RNA的制備
5.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的陽性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。
6.用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
7.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變。
8.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）： 

9.上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）。

四、數(shù)據(jù)處理
10.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。