肝胰腺細小病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Hepatopancreatic Parvovirus(HPV)

產(chǎn)品及特點

肝胰腺細小病毒(Hepatopancreatic Parvovirus，HPV)與對蝦腸道內微生物群落有很大關系，在微生物群落穩(wěn)定且有益微生物較多時，能維持對蝦免疫力水平，從而抑制病毒的感染。反之，微生物群落不穩(wěn)定而遭到破壞時，就極易引起對蝦感染。該病通常是由水質指標(氨氮，亞鹽等)惡化或偏高；天氣變化、突然換料、飼料質量差、纖毛蟲病等引起的。該病的常見癥狀是病蝦反應遲鈍，空胃，不吃食，彈跳無力，漫游池邊或水面，頭胸甲上有明顯的針眼大小不規(guī)則的白色斑點，顯微鏡檢查一般為花骨朵狀的，肝胰臟腫大糜爛或發(fā)紅或體表發(fā)紅，幾天內就會有大量死亡，對海產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重損害，因此肝胰腺細小病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的肝胰腺細小病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2.根據(jù)肝胰腺細小病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。
3.靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4.一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

肝胰腺細小病毒染料法熒光定量PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑   樣品 DNA。

使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千 萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病 原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽 性對照。

2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。

4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)， 充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分 震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

8. 如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照）， 一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋 的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原 液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此 稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加 上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取 決于所用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫φ铡Ｖ苽渌贸蔀闃悠?DNA。

9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼 容。

三、設置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）

10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上 步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標準曲線。如果做定性 分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用 第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟， 定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個，其余不變。

11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢 后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行 優(yōu)化）。

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性