人鼻病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒

Human Rhinovirus

產(chǎn)品及特點

人鼻病毒(Human Rhinovirus)是小RNA病毒科、鼻病毒屬的一種，是人患普通感冒的主要病原。鼻病毒抗原性復(fù)雜，有100多個血清型，感染后可獲得免疫力，但維持時間短，尚無特異預(yù)防和治療方法。該病毒感染后常表現(xiàn)為感冒癥狀，大約有10%~20%的成年人感冒是由HRV感染引起，而嬰幼兒感冒有15%~30%是由HRV致病。該病毒的感染具有自限性，但是有時會引起諸如哮喘、充血性心衰、支氣管擴張，包囊纖維化等嚴(yán)重并發(fā)癥，并且該病毒多與其它呼吸道病毒合并感染，例如呼吸道合胞病毒、腺病毒、副流感病毒、冠狀病毒以及腸道病毒等，對人體健康造成嚴(yán)重損害，因此人鼻病毒通用的快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的人鼻病毒通用染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2.根據(jù)人鼻病毒通用保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng)。
3.靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。
4.一管式熒光定量PCR檢測，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

人鼻病毒通用染料法熒光定量RT-PCR試劑盒規(guī)格及成分

運輸及保存 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

自備試劑   DNA模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。 

使用方法 一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1.注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DN片段作為陽性對照。

2.標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4.在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5.換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8.如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10.如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：

12.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

13.數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理
14.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
15.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。